WWW.GOLKOM.RU   Добавить в Избранное


БИБЛИОТЕКА ПРИРОДЫ
информационный портал

Главная  Новости  Каталог  Книги  КМЭ  Форум

ТУ  Гербарий  Golkom-Balance  Golkom-Post

 
Регистрация:

Краткая медицинская энциклопедия


А Б В Г Д Е Ж З И Й К Л М Н О П Р С Т У Ф Х Ц Ч Ш Щ Э Ю Я

Клетка (дополнение)

Перейти к следующей статье 'КЛЕЩИ'Перейти к предыдущей статье 'КЛЕТКА'КЛЕТКА (дополнение к ст. "Клетка", БМЭ, изд. II, т. 13).

Гистохимия ферментов клетки.

До последних лет развивалась как одно из направлений топохимии. В связи со структурной и функциональной неоднородностью клеточного состава различных органов, например мозга, почек, поджелудочной железы, основное внимание уделялось выяснению методами световой микроскопии приуроченности ферментных систем к тканевым структурам, а также распределению их в пределах клетки; последнее направление начало развиваться с конца 50-х годов. Благодаря успехам электронной микроскопии удалось выяснить отношение отдельных ферментов к субцеллюлярным структурам.

В основе подавляющего большинства качественных гистохимических методов обнаружения локализации ферментов лежит способность последних расщеплять естественные или искусственные субстраты. При помощи гистохимических реакций выявляют продукты ферментативных процессов, выпадающие в местах локализации фермента. Эти продукты переводят в окрашенные соединения, нерастворимые или малорастворимые в воде и органических растворителях, используемых в гистологической технике.

Для обнаружения локализации ферментов в гистохимии используют несколько типов реакций. Методы с образованием осадков солей металлов широко применяют при определении гидролаз. Большое число методов основано на использовании азосочетания как одновременного, так и последующего. Методы последующего азосочетания имеют то преимущество, что при них не происходит угнетения активности ферментов присутствующими в инкубационной среде солями диазония; однако точность локализации фермента при этом снижается за счет диффузии первичного продукта ферментативной реакции. Гистохимия дегидрогеназ и некоторых оксидаз основана на использовании солей тетразолиев, восстанавливающихся путем захвата водорода, который освобождается при окислении тканевых субстратов с образованием плохо или совершенно нерастворимых в водных средах ярко окрашенных формазанов. Применяют соли моно- и дитетразолиев. Наиболее важными из них являются: тетразолий нитро-синий [хлорид 2,2'-ди-п-нитрофенил-5,5'-дифенил-3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-бифенилен)-дитетразолия] и тетразолий тетра-нитро-синий [хлорид 2,2'-5,5'-тетра-п-нитрофенил-3,3'-(3,3'-диметокси-4,4'-5-фенилен)-дитетразолия]. Формазаны этих соединений, помимо нерастворимости в воде, обладают низкой растворимостью в ли-пидах и образуют кристаллы очень мелких размеров.

В ряде методов используется способность фермента синтезировать в условиях гистохимической реакции вещество, которое затем выявляют при помощи цветных реакций. На этом принципе разработан метод определения глюкозанфосфорилазы. Фермент в условиях инкубации синтезирует гликоген, локализацию которого в клетке затем определяют при помощи цветной реакции. В ряде случаев, в частности для обнаружения нуклеодеполимераз (РНК-азы и ДНК-азы), а также протеаз, в том числе пептидаз, используют пленку, обычно из желатины, пропитанную раствором субстрата. При контакте пленки со срезом ткани в местах, соприкасающихся со структурами, обладающими ферментативной активностью, происходит гидролиз субстрата. Затем оставшийся в пленке негидролизованный субстрат окрашивают обычными методами. Применяются меченые соединения, которые при ферментативной реакции дают осадки, включающие метку и выпадающие в местах локализации фермента. В дальнейшем метка обнаруживается методом радиоавтографии (см. Ауторадиография, т. 2). Например, этим методом с использованием тирозина-С14 выявляют локализацию тирозиназы.

Весьма перспективно использование меченых ингибиторов. Так, применение меченного Н3 диизопропилфторфосфата и сочетанное использование радиоавтографии и электронной микроскопии позволило установить распределение активных центров холинэстеразы в моторных бляшках.

Для обнаружения РНК-азы и ДНК-азы с успехом используется метод флюоресцентной метки антител.

Весьма перспективно все более широкое использование индоксилсодержащих субстратов. Расщепление этих субстратов приводит к образованию в местах локализации фермента нерастворимых в воде мелкокристаллических ярко окрашенных индигокрасителей. Индоксилсодержащие субстраты могут быть использованы для определения локализации ферментов, катализирующих реакции разных типов,- гидролаз, пептидаз, транспептидаз и др.

В зависимости от свойств ферментов определение их можно производить в фиксированных и свежих тканях. Так, фосфатазы, неспецифические эстеразы, сульфатазы, нуклеазы и другие ферменты, в той или иной степени резистентные к гистологической обработке, возможно выявлять в срезах лиофилизированных или фиксированных и залитых в парафин и другие среды тканей. Ферменты окислительного обмена (например, цитохромоксидаза), легко повреждаемые агентами разной природы, могут определяться только в срезах свежей ткани. Важно сохранение активности и локализации ферментов, имевших место in vivo. Потеря активности фермента связана не только с его инактивацией при обработке (например, замораживании и оттаивании, взаимодействии с фиксатором), но и диффузией лиокомпонента фермента в среду из образца ткани во время фиксации и инкубации при определении активности. Степень диффузии фермента зависит от его свойств и от характера гистологической обработки. Для уменьшения диффузии в фиксатор и среду для инкубации вводят вещества, препятствующие развитию этого явления (сахарозу, поливинилпирролидон и др.).

Используемые в гистохимии субстраты должны обладать растворимостью в воде, низким молекулярным весом, быстро проникать в клетки и создавать в последних концентрации, достаточные для следования ферментативной реакции кинетике первого порядка (см. Кинетика химическая,, т. 12). Субстрат должен легко подвергаться ферментативному воздействию при значениях рН, соответствующих оптимуму действия фермента; не обладать полярными свойствами, поскольку наличие полярных групп приводит к его связыванию функциональными группами белков. Первичный и конечный продукты гистохимической реакции не должны быть растворимыми в воде и липидах, так как в последнем случае они будут концентрироваться в липидных компонентах клетки.

Из общего числа известных ферментов, приближающегося к 800, около 100 можно идентифицировать в настоящее время методами гисто- и цитохимии. Однако не для всех тинов ферментов имеются простые и достаточно специфичные гистохимические реакции, точно выявляющие локализацию фермента.

С успехом выявляется гистохимически большое число гидролаз. При определении фосфатаз в качестве субстратов используются эфиры и амиды фосфорной кислоты, моно- и диэфиры спиртов и фенолов. В подавляющем большинстве случаев, кроме АТФ, природа радикала не влияет на специфичность реакции. Для выявления неспецифической щелочной фосфатазы методами азосочетания наиболее подходящими субстратами являются фосфорные эфиры сложных арилидов 2-окси-3-нафтойной кислоты.

Методы, основанные на использовании солей тяжелых металлов, позволили установить, что локализация неспецифических кислых фосфатаз (рН оптимума действия 4,5-5,5), как и других кислых гидролаз (кислой РНК-азы, кислой ДНК-азы, арилсульфатазы, (β-глюкуронидазы, катепсина), связана с лизосомами. В методах азосочетания широко используется фосфат α-нафтола, гидролизующийся в кислой среде легче β-нафтилфосфата; находят применение моно- и дигалоидзамещенные нафтилофосфатов, а также производные фосфата нафтола AS.

Для определения ароматических (аромэстераз) и алифатических (алиэстераз) эстераз, эстеразы С в качестве субстратов используются ацетаты нафтолов и фенолов, в том числе замещенные анилиды бензойной кислоты, а также индоксильные эфиры жирных кислот и прежде всего индоксил ацетат. Дифференцировка отдельных эстераз более эффективна путем применения разных ингибиторов, чем субстратов.

Для выявления холинэстераз наиболее эффективен тиохолиновый метод с использованием в качестве субстратов тиоэфиров ацетил- и бутирилхолина. Известный интерес для изучения мионевральных синапсов представляет метод с тиоуксусной кислотой. Установлена локализация холинэстераз в структурах ткани мозга и периферической нервной системы.

Для выявления липаз используют методы с твинами - неполными сложными эфирами жирных кислот и ангидридами гекситов. При инкубации срезов в средах, содержащих твины, образуются кальциевые мыла, которые последовательно переводят в свинцовые мыла и сульфид свинца. На основании гистохимических исследований установлено, что липазная активность представлена в тканях более широко, чем это предполагалось ранее.

Из ферментов, расщепляющих гликозидные связи, наиболее разработана гистохимия (β-D-глюкуронидазы, β-глюкозаминидазы, нейраминидазы (сиалидазы). Для (β-глюкуронидазы, как и других глюкозаминидаз, показана приуроченность к лизосомам.

Из трансгликозилаз наиболее полно изучена фосфорилаза. Гистохимическим методом показано, что болезнь срединной части мышечных волокон связана с отсутствием фосфорилазы в этих зонах мышечных волокон.

Гистохимические реакции разработаны также для некоторых других ферментов, участвующих в синтезе и распаде гликогена - фермента ветвления (Q-фермента), и уридиндифосфатглюкооо-гликогентрансферазы.

Из ферментов, осуществляющих протеолитическую функцию, активность соответствующих пептидаз выявляют при помощи (β-нафтиламидов, D-аланина, L-аланина и L-лейцина.

Разработаны также гистохимические методы, позволяющие с большой надежностью выявлять оксидазы: пероксидазу, цитохромоксидазу, каталазу, тирозиназу, полифенилокеидазу и моноаминоксидазу.

В связи с успехами химии тетразолиевых соединений большого развития достигла гистохимия дегидрирующих ферментов и диафораз, что обеспечивает возможность определения большинства ферментов, связанных с пиридиннуклеотидами, в том числе ферментов цикла Кребса, гликолиза, пентозного цикла и т. д.

Использование методов гистохимии ферментов в разных областях биологии и медицины дало новые материалы для понимания хим. организации и функции клеточных структур. Исследования, проведенные в онтогенетическом плане, обогатили науку новыми сведениями о взаимообусловленности физиологических функций и метаболизма клеточных структур. Гистохимические исследования, проведенные в сочетании с биохимическими, позволили выявить закономерности, лежащие в основе эволюции некоторых сторон метаболизма клетки.

Цветные гистохимические реакции, как правило, позволяют судить о локализации ферментов, но не дают возможности произвести точную количественную оценку их активности в отдельной клетке Поэтому особое значение приобретают разработанные за последнее десятилетие методы количественного определения активности ферментов в отдельных клетках, выделенных из тканевого комплекса. На основе достижений в области микрогазометрии и флюорометрии были разработаны методы определения активности ферментов как в отдельных изолированных клетках, так и в их частях (ядро, ядрышко, оболочка).

Определение активности ферментов при помощи картезианского поплавка, предложенное Линдерстрем-Лангом (К. Linderstrom-Lang) и модифицированное Зейтеном (Е. Zeutnen), используется для изучения активности цитохромоксидазы, сукцинат-дегидрогеназы, холинэстеразы, угольной ангидразы, фосфотидазы А и др. В основе определения активности группы дегидрогеназ, кофактором которых являются НАД или НАДФ, дегидрогеназ лактата, глютамата, малата, глюкозо-6-фосфата и др. лежит флюорометрическое определение окисленной или восстановленной формы пиридин-нуклеотидов, предложенное Лаури (О. Н. Lowry).

Определение активности ферментов в отдельных изолированных клетках находит применение при исследовании метаболизма мозга, почек, поджелудочной железы. При исследовании нервной ткани эти методы используются для изучения специфики метаболизма невронов из разных образований мозга, особенностей обмена органелл нервной клетки, обменных процессов, лежащих в основе функциональных взаимоотношений неврона и глии, и влияния фармакологических агентов и патогенных факторов среды на метаболизм неврона и глии. Определение активности ферментов в отдельной изолированной клетке позволит значительно глубже проникнуть в интимные механизмы обмена веществ клетки.

В. Португалов, И. Краснов.

Электронная микроскопия клетки.

Детальное изучение ультраструктур клетки стало возможным только благодаря применению электронного микроскопа. Для электронно-микроскопического исследования клетки фиксируют четырехокисью осмия или глютаральдегидом, заливают в метакрилат или эпоксидные смолы и делают ультратонкие срезы, которые окрашивают или контрастируют растворами окиси свинца, у ранил ацетатом и другими веществами. При помощи электронной микроскопии изучены ультраструктуры ядра, цитоплазмы и различных органоидов и включений. Для всех клеток характерны органоиды общего характера, выполняющие основные жизненные функции. Это митохондрии, аппарат Гольджи, эндоплазматическая сеть, центриоли и, вероятно, лизосомы. Кроме того, в клетках различных типов имеются органоиды специального назначения, связанные с выполнением некоторых специфических функций. Это миофибриллы, реснички и жгутики, нейрофибриллы, тонофибриллы и т. п.

Ультраструктура цитоплазмы, ядра и органоидов общего характера (рис. 1). Для всех клеток характерно наличие поверхностной цитоплазматической мембраны толщиной около 75 А. Она состоит из двух плотных протеиновых слоев и промежуточного бимолекулярного липидного слоя; толщина каждого слоя элементарной мембраны около 25 А. Такая трехслойная ультраструктура свойственна и другим клеточным мембранам. Предполагается, что в поверхностной цитоплазматической мембране имеются специальные ферменты, контролирующие поступление веществ в клетку и их выход из нее. Основное вещество цитоплазмы выглядит гомогенным или мелкозернистым. Иногда в нем видны тонкие нити толщиной 70-100 А.

Эндоплазматическая сеть образована сложной системой канальцев, вакуолей и цистерн, ограниченных элементарными мембранами. Их профили округлы или продолговаты, а диаметр колеблется от 200 до 3000 А. На наружной поверхности мембран очень часто располагаются гранулы диаметром около 150-200 А. Это рибосомы. В них, помимо белков, содержится большое количество РНК. Рибосомы могут располагаться и свободно в матриксе цитоплазмы. Эндоплазматическая сеть с рибосомами, обозначаемая как шероховатая, или гранулярная, характерна для базофильных участков цитоплазмы, интенсивно синтезирующих белок. Особенно сильно развита "шероховатая" эндоплазматическая сеть в секреторных клетках, например в ацинозных клетках поджелудочной железы, клетках печени и т. п. (рис. 2). Другая, так наз. гладкая разновидность эндоплазматической сети характеризуется тем, что на ее мембранах отсутствуют рибосомы. Канальцы гладкой сети имеют диаметр 500-1000 А и наиболее развитые клетки, секретирующих липиды и углеводы. Обе формы эндоплазматической сети встречаются во всех животных клетках, кроме зрелых эритроцитов В недифференцированных клетках эндоплазматическая сеть развита слабо. Мембраны эндоплазматической сети связаны с мембранными структурами аппарата Гольджи, митохондрий, ядра и клеточной оболочки. Эндоплазматическая сеть принимает участие в синтезе белка, транспортировке синтезированных продуктов, накоплении веществ, поступающих из лизосом или пиноцитозных вакуолей.

Рис. 1. Современная схема ультраструктурной организации клетки: 1 - пиноцитозный пузырек; 2 - эндоплазматическая сеть; 3 - митохондрии; 4 - клеточная мембрана; 5 - ядерная оболочка; б - ядрышко; 7 - ядро; 8 - лизосома; 9 - центросома; 10 - аппарат Гольджи; 11 - цитоплазма.



Рис. 1. Современная схема ультраструктурной организации клетки: 1 - пиноцитозный пузырек; 2 - эндоплазматическая сеть; 3 - митохондрии; 4 - клеточная мембрана; 5 - ядерная оболочка; б - ядрышко; 7 - ядро; 8 - лизосома; 9 - центросома; 10 - аппарат Гольджи; 11 - цитоплазма.



Митохондрии снаружи покрыты элементарной мембраной. Между ней и внутренней мембраной имеется щелевидное пространство, ширина которого варьирует от 100 до 300 А. Это пространство заполнено белковым компонентом, сходным с веществом гомогенного матрикса и заполняющим все внутреннее содержимое митохондрии. Внутренняя мембрана митохондрии образует складки, или перегородки, называемые кристами, или гребнями. Они глубоко вдаются в матрикс (рис. 2). Обычно кристы располагаются параллельно друг другу и ориентированы поперек продольной оси митохондрии. Стенка крист образована элементарной трехслойной мембраной. Количество крист может варьировать. По-видимому, оно зависит от активности дыхательной функции митохондрий. На внутренних митохондриальных мембранах локализуются ферменты, осуществляющие перенос электронов и окислительное фосфорилирование. При негативном контрастировании митохондрий на кристах выявляются многочисленные грибовидные тельца неизвестной природы диаметром около 80 А, сидящие как бы на ножке, длиной 40-50 А; они легко разрушаются при фиксации четырех окисью осмия.

Рис. 2. Небольшой участок экзокринной клетки поджелудочной железы летучей мыши. В центре - митохондрии, справа - каналы эндоплазматической сети с рибосомами.



Рис. 2. Небольшой участок экзокринной клетки поджелудочной железы летучей мыши. В центре - митохондрии, справа - каналы эндоплазматической сети с рибосомами.



Основная ультраструктура аппарата Гольджи - гладкие трехслойные мембраны, составляющие стенки уплощенных мешочков, или цистерн, которые обычно лежат пакетами. В каждом из них имеется от 4-5 до 8-12 мешочков. На разрезах они имеют вид мембран, расположенных парами параллельно друг другу (рис. 3). Ширина просвета между ними в центральной части около 150-200 А; по краям мешочка просвет расширяется до 500 А. У концов уплощенных мешочков расположены мелкие пузырьки диаметром 300-600 А. В средней части каждой пачки уплощенных мешочков лежат отпочковавшиеся от них крупные вакуоли (до 0,3 μ). Предполагают, что аппарат Гольджи обеспечивает сепарацию и конденсацию веществ в клетке.

В цитоплазме различных клеток обнаружены лизосомы - небольшие тельца, окруженные одной элементарной мембраной. В лизосомах содержится набор гидролитических ферментов, способных расщеплять протеины, нуклеиновые кислоты и полисахариды.

Сочетание цитохимических методов с электронной микроскопией позволило установить наличие в лизосомах кислой фосфатазы. Предполагается, что лизосомы выполняют функцию "пищеварительной системы" клетки.

Центриоль под электронным микроскопом имеет вид цилиндра диаметром около 1500 А. Его стенки состоят из 9 групп трубочек длиной до 5000 А. Они расположены по окружности и имеют диаметр 150-200 А. В каждой группе число трубочек варьирует от 1 до 3. Ультратонкое строение центриоли сходно с таковым базальных телец ресничек и жгутов.

Поверхность ядра клетки покрыта оболочкой, состоящей из двух элементарных мембран: внутренней и внешней. Между ними находится перинуклеарное пространство шириной до 300 А. С внешней мембраной обычно связаны рибосомы. Эта мембрана представляет собой элемент эндоплазматической сети, окружающей ядро. Можно видеть как мембраны сети соединяются с внешней мембраной ядра. Перинуклеарное пространство сообщается с каналами эндоплазматической сети и через них с внешней средой. Ядерная мембрана имеет множество пор диаметром 200-300 А. В нуклеоплазме интерфазного ядра видны многочисленные гранулы - рибосомы, содержащие РНК, и тонкие спирально извитые двойные нити толщиной около 100 А. Хромосомы, хорошо видимые в митозе образованы такими же нитями, или протофибриллами. Эти протофибриллы в интерфазном и митотическом ядре находятся в разной степени спирализации. Характерные ультраструктуры ядра в виде спиральных извитых двойных нитей представляют собой дезоксирибонуклеопротеидные комплексы.

Рис. 3. Аппарат Гольджи бокаловидной клетки (электронная микроскопия): 1 - пакеты уплощенных мешочков; 2 - мелкие пузырьки; 3 - крупные вакуоли.



Рис. 3. Аппарат Гольджи бокаловидной клетки (электронная микроскопия): 1 - пакеты уплощенных мешочков; 2 - мелкие пузырьки; 3 - крупные вакуоли.



Ядрышко состоит из матрикса, имеющего гранулярное строение, и нуклеолонемы, включенной в матрикс. В нуклеолонеме видны спирально извитые фибриллы толщиной до 100 А и многочисленные гранулы диаметром 100-200 А. Основную массу ядрышка составляют кислые белки, связанные с РНК.

В разных клетках в зависимости от их функционального состояния ультраструктуры органоидов могут претерпевать некоторые изменения, сохраняя, однако, свое типичное строение.

Е. Хейсин.


Краткая Медицинская Энциклопедия, издательство "Советская Энциклопедия", издание второе, 1989, Москва


Поделитесь в социальных сетях:





Главная  Новости  Каталог  Книги  КМЭ  Форум

ТУ  Гербарий  Golkom-Balance  Golkom-Post


Copyright © 2002-2022 "Библиотека природы"
По вопросам размещения рекламы на сайте: info@golkom.ru