WWW.GOLKOM.RU   Добавить в Избранное


БИБЛИОТЕКА ПРИРОДЫ
информационный портал

Главная  Новости  Каталог  Книги  КМЭ  Форум

ТУ  Гербарий  Golkom-Balance  Golkom-Post

 
Регистрация:

Книжная полка - Теория мягких косметологических воздействий. Современная косметология. Децина А.Н. - Глава 9 Следующая страницаПредыдущая страница

9. Некоторые механизмы старения кожи

В настоящее время известны сотни гипотез о биологической сущности старения организма. Можно полагать, что в любых научных дисциплинах количество гипотез, описывающих то или иное явление, обратно пропорционально ясности вопроса о механизме этого явления. Современная наука не может предотвратить старость, однако имеющиеся данные позволяют формулировать подходы к предупреждению преждевременной старости.

Кожа, представляющая самый большой орган человека, посредством которого осуществляется воздействие окружающей среды на организм, непосредственно подвержена процессам, сопровождающим старение.

Существуют генетические теории старения, в которых ген расценивают как первичный участок, в котором могут возникать изменения, индуцирующие процесс старения. В противовес этим теориям указывается на то, что такие факторы окружающей среды, как температура, влажность, питание и стресс, также способны влиять на скорость процесса старения. Однако можно полагать, что такие (как бы противоположные) подходы в действительности могут быть взаимосвязанными.

Имеются гипотезы, основанные на изменении содержания ферментов и гормонов, распространены версии, учитывающие образование сшивок в макромолекулах (включая нуклеиновые кислоты, коллаген, полисахариды и т.д.), изменение проницаемости мембран, строения различных органелл типа лизосом и митохондрий. Имеющиеся данные свидетельствуют о том, что все перечисленные выше изменения, сопровождающие процесс старения организма, подтверждаются экспериментально. Более того, есть основания полагать, что большая часть этих изменений связана между собой и, очевидно, с теми процессами, которые регистрируются на генетическом уровне.

Таким образом, мы имеем дело с гигантским клубком взаимосвязанных событий, сопровождающих процесс старения организма. Поэтому любые попытки объяснить процесс старения, принимая во внимание только отдельные факторы, на наш взгляд, заранее обречены на неудачу. Однако имеется еще несколько ключевых факторов, сопровождающих процесс старения, информация о которых к настоящему времени накоплена, и которые, с теоретической точки зрения, могут иметь определяющее значение на протекании всего процесса в целом. Одним из таких факторов является перекисное окисление липидов.

9.1. Перекисное окисление липидов

Все живое на земле состоит из клеточных систем. Особенностью любой клетки организма животного является наличие внешней и внутренних бислойных мембран. На рис.9.1 представлено схематическое изображение молекулы лецитина и фрагмента бислойной мембраны, составленной из молекул лецитина.

Наличие двойных связей в жирнокислотных "хвостах" молекулы лецитина определяет реакционную способность бислойных мембран по отношению к окислителям различного типа (О2, О3, Н2О2, ионы переходных металлов и т.д.), излучениям, радиации и т.п.

Кислород воздуха, необходимый для существования всего живого на Земле, участвует в процессе перекисного окисления липидов (ПОЛ), в результате которого образуются активные высокореакционноспособные частицы. Эти частицы способны продолжать процесс ПОЛ, который обычно протекает по цепному механизму. Кроме этого, они могут взаимодействовать с биополимерами, меняя их структуру и свойства.

Рисунок 9.1 Схематическое изображение молекулы лецитина и фрагмента бислойной мембраны

Схематическое изображение молекулы лецитина и фрагмента бислойной мембраны

На рис.9.2 представлена брутто-схема ПОЛ, завершающаяся образованием реакционноспособных альдегидов.

Рисунок 9.2 Схема перекисного окисления липидов

Схема перекисного окисления липидов

Образующиеся в процессе ПОЛ альдегиды легко (даже при комнатной температуре) вступают в реакцию с аминогруппами аминокислот, пептидов и белковых фрагментов, протеогликанов, липопротеидов, мукополисахаридов и с нуклеиновыми кислотами. На рис.9.3 представлена схема модификации белкового фрагмента под влиянием альдегидов, образующихся в процессе ПОЛ.

Реакция альдегидов с аминокислотами, пептидами и белковыми фрагментами, называемая реакцией неферментативного покоричневения, реакцией меланоидирования или реакцией Майяра (Майларда), интенсивно изучаемая во второй половине XX века [1], осуществляется по достаточно сложной схеме с промежуточным образованием парамагнитных частиц (свободных радикалов). Также было показано, что процесс может замедляться в присутствии антиоксидантов. В основном используемые антиоксиданты относились к неорганическим соединениям типа диоксида серы, солей сернистой и азотной кислот. Имеются сведения о возможности ингибирования реакции Майяра меркаптоэтанолом.

Установлено, что некоторые продукты реакции альдегидов и восстанавливающих сахаров (например, глюкозы) с аминокислотами обладают мутагенным действием и проявляют токсичность.

Совершенно очевидно, что по мере развития процесса ПОЛ (см. рис.9.2), образующиеся альдегиды могут вступать в реакцию Майяра (см. рис.9.3). В свою очередь, по мере накопления изменений в структуре белковых фрагментов биологических полимеров последние могут прекращать осуществление своих биологических функций или, в конце концов, превращаться в белковые образования, не узнаваемые иммунной системой организма. Появление таких чужеродных белковых молекул может провоцировать развитие аллергических реакций.

Рисунок 9.3 Схема модификации белкового фрагмента под влиянием альдегидов

Схема модификации белкового фрагмента под влиянием альдегидов

Взаимодействие продуктов ПОЛ с нуклеиновыми кислотами может вызывать изменения в их структуре и при соответствующем накоплении повреждений - изменения в генетическом аппарате клетки (мутагенное действие продуктов ПОЛ).

Взаимодействие продуктов ПОЛ с мукополисахаридами типа гиалуроновой кислоты будет вызывать изменения в её структуре, которые могут приводить к снижению проницаемости геля гиалуроновой кислоты с водой, заполняющего межклеточное пространство в эпидермисе и в дерме, и тем самым влиять на проницаемость кожи.

Таким образом, продукты ПОЛ могут быть ответственными за аллергические проявления, мутации и снижение проницаемости кожи.

Вообще, именно в силу особенностей строения клеток, ПОЛ всегда сопровождает животных в обычных условиях (в норме). Есть основания считать, что ПОЛ заметно усиливается при неблагоприятных воздействиях.

9.1.1. Оценка склонности липидов к перекисному окислению

Содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в тканях при хронических заболеваниях (см., например, [2-7]) и при других неблагоприятных воздействиях на организм возрастает по сравнению с нормальным проявлением процесса ПОЛ. В большинстве случаев при этом в жирнокислотных составах липидов наблюдаются изменения, характеризующиеся снижением содержания ненасыщенных жирных кислот [8]. Есть основания полагать, что именно ПОЛ является процессом, определяющим направление и глубину наблюдаемых изменений в жирнокислотных составах липидов тканей организма при неблагоприятных воздействиях. Поэтому при оценке степени ненасыщенности липидов или при выявлении их склонности к перекисному окислению (в качестве отклика на неблагоприятные воздействия) целесообразно пользоваться обобщенным индексом, учитывающим суммарную ненасыщенность липидов и/или их реакционную способность в процессах ПОЛ.

Обычно для выявления суммарной ненасыщенности или для оценки склонности липидов к окислению используются индексы ненасыщенности, определяемые отношением суммарных количеств полиненасыщенных жирных кислот (две двойные связи и более) к насыщенным [9], суммой произведений процентного содержания кислот на число двойных связей с каждой из них [8] и т.д. Однако использование этих индексов в редких случаях является достаточно обоснованным и, самое главное, может таить возможность ошибочных выводов и заключений, связанных с тем, что они не учитывают истинную реакционную способность жирнокислотных фрагментов липидов в процессах ПОЛ.

В табл.9.1 представлены относительные скорости окисления индивидуальных жирных кислот в зависимости от количества двойных связей (по данным, приведенным в работе [10]).

При расчете коэффициентов реакционной способности применялись относительные скорости окисления жирных кислот при 37°С. Однако из-за отсутствия сопоставимых данных для жирных кислот, не имеющих С=С связей, переход к насыщенным системам осуществлялся с учетом относительных скоростей окисления стеариновой и олеиновой кислот при 110°C. Из данных, представленных в табл.9.1, видно, что повышение температуры процесса окисления приводит к сглаживанию различий в относительной реакционной способности исходных соединений. Поэтому можно ожидать, что соотношение склонностей к окислению стеариновой и олеиновой кислот при 37°C будет более высоким, чем 1:11. Однако, учитывая их весьма низкие абсолютные скорости окисления, которые при наличии полиненасыщенных жирных кислот вносят незначительный вклад в общую реакционную способность липидов, ожидаемыми различиями можно пренебречь.

Таблица 9.1 Относительная реакционная способность жирных кислот в процессах перекисного окисления и коэффициенты реакционной способности

Относительная реакционная способность жирных кислот в процессах перекисного окисления и коэффициенты реакционной способности

В соответствии с вышеизложенным, индексы реакционной способности к ПОЛ (ИРСПОЛ) предлагается рассчитывать по следующей формуле:

ИРСПОЛ=∑CiKi, (1)

где Ci - относительное содержание индивидуальных (насыщенных и ненасыщенных) жирных кислот, а Ki - коэффициент реакционной способности (см. табл.9.1).

Для проверки наличия связи между ИРСПОЛ и традиционно используемыми индексами ненасыщенности был проведен расчет их значений для 52 наборов жирнокислотных составов липидов, приведенных в работах [11-17], а также изучено наличие зависимостей между полученными величинами. Оказалось, что для большинства вариантов расчетов индексов ненасыщенности их корреляция с ИРСПОЛ является достоверной, хотя и не очень высокой (коэффициент корреляции ниже 0.77) Для индекса ненасыщенности, определяемого по формуле (2):

ИН=∑Cini, (2)

коэффициент линейной корреляции оказался несколько более высоким (0.83). Здесь ni - число двойных связей в индивидуальной жирной кислоте, а Ci- её относительная концентрация. Однако и в этом случае расхождения между величинами индексов ненасыщенности, рассчитанными по формуле (2) и предложенному нами регрессионному уравнению (3).

ИН=52.6+0.00165 ИРСПОЛ (3),

могут оказаться достаточно высокими и достигать в отдельных случаях 40-50%.

В качестве примера, свидетельствующего о практической важности адекватного выбора критерия оценки, можно сослаться на результаты работы [12], авторы которой изучали действие радиации на культуру клеток LDV, меняя жирнокислотный состав клеточных липидов посредством добавления в питательную среду олеиновой (С18:1) и линолевой (С18:2) кислот. Зафиксированное при этом увеличение содержания в клеточной мембране соответствующих кислот (см. табл.9.2) рассматривалось как повышение степени ненасыщенности.

Таблица 9.2 Сопоставление индексов ненасыщенности и индексов реакционной способности липидов цитоплазматических мембран клеток

Сопоставление индексов ненасыщенности и индексов реакционной способности липидов цитоплазматических мембран клеток

*) Индексы ненасыщенности и ИРСПОЛ рассчитывались по формулам (1) и (2) для всего набора жирных кислот, приведенных в [12].

Обнаружив отсутствие заметных различий в склонности клеток с разным содержанием жирных кислот С18:1 и С18:2 к радиационному воздействию, авторы сделали вывод о том, что вызываемое радиацией ПОЛ цитоплазматических мембран не является определяющим в процессе клеточного радиационного повреждения. Проведенный нами расчет ИРСПОЛ по данным этой работы (см. табл.9.2) показал, что, несмотря на увеличенное содержание некоторых жирных кислот при введении в питательную среду их эндогенных аналогов, существенного изменения значений индексов не происходит в связи со снижением общего количества других полиненасыщенных (более реакционноспособных) кислот. Следует подчеркнуть, что использование индексов ненасыщенности, рассчитываемых по формуле (2), наиболее близких к ИРСПОЛ, также приводит к аналогичным результатам (см. табл.9.2). Таким образом, вывод авторов работы [12] мог претерпеть существенные изменения, если бы они воспользовались индексами, в большей степени отражающими реакционную способность липидов в процессах ПОЛ.

Другие примеры свидетельствуют о наличии различий между ИРСПОЛ и разнообразными вариантами индексов ненасыщенности. Так, в работе [8] приводятся индексы ненасыщенности липидов печени при её хронических поражениях, определяемые по формуле (2). На основании величин этих индексов авторы делают вывод о том, что наиболее значительные изменения ненасыщенности наблюдаются при портальном и билиарном циррозах печени (см. табл.9.3)

Таблица 9.3 Сопоставление индексов ненасыщенности и индексов реакционной способности липидов печени в норме, а также при хронических гепатитах, циррозах и жировом гепатозе (по данным работы [8])

Сопоставление индексов ненасыщенности и индексов реакционной способности липидов печени в норме, а также при хронических гепатитах, циррозах и жировом гепатозе (по данным работы [8])

Однако величины ИРСПОЛ, которые также могут характеризовать глубину изменений ненасыщенности и направление этих изменений, свидетельствуют о том, что, если для портального цирроза и наблюдается некоторое снижение ИРСПОЛ, сопоставимое с ошибкой определения (примерно 20%)*), то для билиарного цирроза эта величина практически не отличается от соответствующих значений для других заболеваний печени (см. табл.9.3).

*) Индексы ненасыщенности и ИРСПОЛ рассчитывались по формулам (1) и (2) для всего набора жирных кислот, приведенных в [8].

Если рассмотреть данные, полученные в работе [9], характеризующие изменения состава жирных кислот мембран эритроцитов, тромбоцитов и липидов плазмы крови при заболевании гиперлипопротеидемией, то вывод, который можно было бы сделать на основании значений индексов ненасыщенности (увеличение степени ненасыщенности при заболевании), оказался бы некорректным, так как значения ИРСПОЛ у больных и у здоровых людей практически не отличаются (см. табл.9.4).

Число подобных примеров может быть значительно увеличено, так как изучение связи между неблагоприятными воздействиями на организм и усилением процессов ПОЛ привлекает пристальное внимание исследователей (см., например, [2-4, 9]).

Отметим также, что использование любых индексов, отражающих относительную ненасыщенность (реакционную способность) липидов, без учета их общего содержания в клетках, органах и т.п., не всегда является методически оправданным.

Таким образом, мы предложили новые индексы реакционной способности (ИРСПОЛ), характеризующие склонность липидов к ПОЛ, а также глубину и направление изменений ненасыщенности липидов. Использование этих индексов может иметь определенное преимущество по сравнению с традиционно применяемыми в таких случаях индексами ненасыщенности.

Таблица 9.4 Сопоставление индексов ненасыщенности и индексов реакционной способности липидов плазмы крови, мембран эритроцитов и тромбоцитов здоровых людей и больных гиперлипопротеидемией II типа (по данным работы [9])

Сопоставление индексов ненасыщенности и индексов реакционной способности липидов плазмы крови, мембран эритроцитов и тромбоцитов здоровых людей и больных гиперлипопротеидемией II типа (по данным работы [9])

*)Индексы ненасыщенности рассчитывались по формуле (4):

(4)

где Сi соответствует относительной концентрации полиненасыщенной кислоты (n=2), а ni - количество двойных связей в её молекуле; Сj - относительная концентрация насыщенной кислоты.

В дальнейшем мы используем значения ИРСПОЛ для оценки склонности различных жировых систем к прогорканию.

9.1.2. Уровень карбонильных соединений при культивировании клеток

Предложенные индексы реакционной способности ИРСПОЛ характеризуют склонность липидов к перекисному окислению. Однако, насколько далеко заходит процесс перекисного окисления, например, при культивировании клеточных систем, и, вообще, является ли образование продуктов ПОЛ величиной осязаемой? Для решения этих вопросов мы предприняли специальное исследование.

Следует заметить, что продукты ПОЛ (альдегиды и кетоны) в большинстве случаев в разбавленных растворах являются достаточно устойчивыми соединениями, и поэтому можно ожидать их накопления в системе клетка - питательная среда при проведении процесса культивирования в неблагоприятных условиях.

Эти обстоятельства позволяли надеяться, что, по крайней мере, для некоторых клеточных линий, используемых в производстве вакцинных препаратов, может существовать зависимость между качеством культивирования (оптимальность условий культивирования, ростовые характеристики питательных сред, неблагоприятные воздействия) и уровнем карбонильных соединений в питательной среде в процессе клеточной жизнедеятельности.

Целью данной работы являлось изучение динамики изменения уровня карбонильных соединений в процессе клеточного роста и выявление связи этого уровня с качеством культивирования клеток на примере фибробластов почек сирийского хомячка (ВНК-21).

В качестве опытных питательных сред использовали препараты, приготовленные во ВНИИ молекулярной биологии на основе индивидуальных аминокислот, гидролизата протеинов миражного яйца, рыбного гидролизата и автолизата пекарских дрожжей разной степени очистки.

Для проведения анализа применяли соляную кислоту и едкий натр квалификации х.ч., а также 2,4-динитрофенилгидразин (ДНФГ) марки ч.

Оптические плотности поглощения растворов определяли на спекрофотометре СФ-26 в кварцевой кювете с толщиной поглощающего слоя 1 см. В качестве раствора сравнения использовали дистиллированную воду.

Культуру клеток ВНК-21 (с.13) в соответствии с паспортными данными получали в музее клеточных культур ВНИИ молекулярной биологии.

Клетки выращивались на исследуемых питательных средах в монослое с посадочной концентрацией 100 тыс. кл./мл Продолжительность одного пассажа составляла 72 часа. Индексы пролиферации и количество клеток оценивали по известной методике (см., например [18]).

Уровень карбонильных соединений в надклеточной жидкости и в исходных питательных средах определяли в соответствии с методикой [19] с небольшой её модификацией. Для этого к 0.6 мл надклеточной жидкости или питательной среды добавляли 0.5 мл насыщенного раствора ДНФГ в 1Н растворе соляной кислоты. Пробы выдерживали 10-20 минут при комнатной температуре, затем приливали 2 мл 0.4 Н раствора едкого натра и после выдерживания в течение 10-20 минут при комнатной температуре измеряли оптическое поглощение растворов при длине волны 505 нм (Д505).

В качестве контроля при определении Д505 использовали пробы, приготовленные по аналогичной методике, в которой изменяли порядок добавления растворов к исследуемому образцу (вначале добавляли раствор щелочи, а затем - раствор ДНФГ).

Для решения поставленной задачи вначале был проведен анализ содержания карбонильных соединений в некоторых исходных питательных средах, содержащих сыворотку крови крупного рогатого скота и выдержанных при 37°C в течение 72 часов (см. табл.9.5). Полученные данные свидетельствуют о довольно низких уровнях карбонильных соединений в исходных питательных средах.*) Этот уровень несколько повышается в процессе обработки при 37°C (обычная продолжительность одного пассажа).


*) Низкий уровень карбонильных соединений связан с незначитеьлным содержанием этих соединений в исходных составах питательных сред (пиридоксаль и др.). Следует заметить также, что более богатая карбонильными соединениями сыворотка добавляется к среде в количестве 10%.

Однако наблюдаемые изменения оказываются незначительными по сравнению с повышением уровня карбонильных соединений в процессе культивирования клеток ВНК-21 (см. табл.9.6)

Таблица 9.5 Уровень карбонильных соединений в некоторых питательных средах*)

Уровень карбонильных соединений в некоторых питательных средах

*)Образцы питательных сред в разных опытах отличались между собой датами изготовления как питательных сред, так и сывороток. В опытах со средой Игла МЕМ использовались различные партии эмбриональной сыворотки (фирма "Flow") и один образец сыворотки КРС, обработанной полиэтиленгликолем.

Данные, приведенные в табл.9.6, свидетельствуют о значительных колебаниях абсолютных значений Д505 в процессе выращивания клеток. Особенно контрастными эти колебания оказались в опытах с посевной концентрацией клеток 200 тыс. кл./мл Здесь на вторые сутки наблюдается достоверное снижение Д505 (в 2 раза) с последующим резким повышением этой величины на третий день культивирования. В отличие от этого, для посевной дозы 50 тыс. кл./мл наблюдается некоторое повышение Д505 на вторые сутки с последующим снижением, а для посевной дозы 300 тыс. кл./мл - более или менее монотонное увеличение этой величины к концу пассажа.

Таблица 9.6 Изменение уровня карбонильных соединений в процессе культивирования клеток ВНК-21 (по суткам) в зависимости от посадочной концентрации клеток

Изменение уровня карбонильных соединений в процессе культивирования клеток ВНК-21 (по суткам) в зависимости от посадочной концентрации клеток

*) Опыт проведен в трехкратной повторности; + М соответствует среднеквадратичному отклонению.

Наблюдаемые изменения свидетельствуют о том, что карбонильные соединения могут не только накапливаться в питательной среде, но и расходоваться в процессе культивирования. Устойчивость образующихся карбонильных соединений в условиях культивирования была доказана в ходе контрольного эксперимента, который заключался в том, что питательную среду после проведения культивирования освобождали от клеток и выдерживали в условиях стерильности при 37°C в течение 72 часов. Оказалось, что величины Д505, определяемые до и после культивирования, практически не отличались. Это указывает на то, что наблюдаемое снижение уровня карбонильных соединений (см. табл.9.6) может осуществляться только за счет их утилизации клетками.

Однако абсолютные значения величины прироста оптической плотности являются недостаточно показательными. На наш взгляд, более информативной является оценка изменений оптической плотности в пересчете на одну клетку. Поэтому был предложен индекс изменения уровня карбонильных соединений под влиянием одной клетки (Икс), рассчитываемый по формуле

, (1)

где Nt является величиной, характеризующей количество клеток в 1 мл культуральной жидкости в момент времени t.

Значения этих индексов, рассчитанные по данным табл.2, представлены на рис.9.4 в зависимости от времени культивирования. Обращает на себя внимание то обстоятельство, что после первых суток культивирования величина Икс обратно пропорциональна величине посевной дозы. Причем в этот момент величины Икс для посадочных доз 50 и 300 тыс. кл./мл отличаются в 12 раз. Так как снижение посевной дозы клеток ухудшает условия клеточного роста, увеличивая лаг-период [20], и, очевидно, приводя к изменениям метаболических процессов, можно полагать, что предложенные индексы могут служить показателями культивирования.

Рисунок 9.4 Зависимость величины индексов карбонильных соединений от продолжительности культивирования клеток ВНК-21 с различной посевной концентрацией

Зависимость величины индексов карбонильных соединений от продолжительности культивирования клеток ВНК-21 с различной посевной концентрацией

Если это предположение является верным, то наблюдаемая к концу культивирования нивелировка значения Икс может означать выравнивание условий культивирования. Более того, направление и интенсивность изменений индексов в течение последних двух суток для посевных доз 50 и 300 тыс. кл./мл могут свидетельствовать о том, что качество культивирования, проявляющееся в потенции клеток к размножению, для клеточного пула с низкой посевной дозой является повышенным. Повышение потенции пула клеток можно зарегистрировать на следующих пассажах культивирования. Поэтому был проведен опыт, результаты которого подтверждают это предположение (см. табл.9.7)

Таблица 9.7 Изменение ростовой активности клеток ВНК-21 и уровня карбонильных соединений в надклеточной жидкости в зависимости от посадочной концентрации

Изменение ростовой активности клеток ВНК-21 и уровня карбонильных соединений в надклеточной жидкости в зависимости от посадочной концентрации

Действительно, в этом опыте на первые сутки культивирования наблюдалось различие величин Икс для посевных доз 50 и 300 тыс. кл./мл, хотя и не такое существенное, как в предыдущем опыте. По истечении трех суток (конец первого пассажа) величины этих индексов сблизились. Это давало основание полагать, что характер изменений величин Икс аналогичен предыдущему опыту. Последующий пересев этих клеточных пулов с использованием стандартной посадочной концентрации клеток (100 тыс. кл./мл) выявил повышенную ростовую активность тех клеток, которые предварительно культивировались с посадочной концентрацией 50 тыс.кл./мл. Об этом свидетельствовали как величины достигаемой клеточной плотности, так и значения Икс .

Необходимо отметить, что аналогичные изменения ростовой активности клеток довольно часто наблюдаются при проведении биологического контроля путем культивирования клеток в течение 4-6 последовательных пассажей в тех случаях, когда не точно выдерживается или специально на одном из пассажей снижается посевная доза.

Из данных, приведенных в табл.9.7, следует, что качество культивирования на втором пассаже для любой из использованных посадочных доз было более высоким, по сравнению с предыдущим пассажем. Можно было полагать, что такое адаптационное улучшение качества культивирования наблюдается не всегда. Для выяснения этого вопроса культивирование клеток ВНК-21 проводилось на питательных средах, обладающих как хорошими, так и плохими ростовыми характеристиками в течение четырех последовательных пассажей. Посадочная доза клеток во всех этих случаях составляла 100 тыс. кл./мл. Результаты экспериментов, приведенных в табл. 9.8 могут свидетельствовать о том, что среды, обладающие достаточно высокой ростовой активностью, оцениваемой по средней величине индексов пролиферации (ИП1-4) имеют тенденцию к снижению Икс . В токсичных питательных средах наоборот, эта величина резко повышается уже на втором пассаже, вслед за которым начинается дегенерация клеток.

Обращает на себя внимание то обстоятельство, что в питательных средах с низкой ростовой активностью величины Икс оказываются относительно высокими уже после первого пассажа. Эти наблюдения легли в основу серии экспериментов, предпринятых для выявления возможной количественной связи между величинами ИП1-4 и Икс, определяемыми после проведения первого пассажа (И1кс). Результаты экспериментов представлены на рис.9.5. Было получено регрессионное уравнение

ИП1-4=14,3 - 57,3 И1кс·106, (2)



Рисунок 9.5 Зависимость средней величины индексов пролиферации клеток ВНК-21 по четырем пересевам от индексов карбонильных соединений на первом пассаже

Зависимость средней величины индексов пролиферации клеток ВНК-21 по четырем пересевам от индексов карбонильных соединений на первом пассаже

Уравнение (2) позволяет предсказывать величину ИП1-4, являющуюся ростовой характеристикой питательной среды, без проведения всех четырех последовательных пассажей культивирования. Среды, для которых И1кс·106>0,25, могут быть отнесены к токсичным. Ошибка измерений по ИП1-4 по уравнению (2) при уровне вероятности 95% составляет ±2.5 единиц ИП. Многократная проверка подтвердила справедливость этого уравнения, которое может использоваться в качестве основы экспрессной методики биоконтроля с применением клеток ВНК-21.

Таблица 9.8 Изменения индексов карбонильных соединений в питательных средах, обладающих различными ростовыми характеристиками, при культивировании клеток ВНК-21 в течение четырех последовательных пассажей

Изменения индексов карбонильных соединений в питательных средах, обладающих различными ростовыми характеристиками, при культивировании клеток ВНК-21 в течение четырех последовательных пассажей

*) Дегенерация клеток

Таким образом, на основании изучения динамики изменения уровня карбонильных соединений в питательной среде при культивировании клеток ВНК-21 предложен новый индекс (Икс), позволяющий количественно оценивать ростовые характеристики питательных сред. Наличие связи между этими параметрами, а также результаты экспериментов с варьированием посевной дозы клеток позволяют предположить, что предлагаемый индекс может служит критерием качества культивирования клеток ВНК-21.

Представлялось интересным проверить возможность применения этого индекса к другим типам клеточных культур. Можно было полагать, что для однотипных культур, например, для клеток почки зеленой мартышки (Vero) или для клеток почки собаки (МДСК), будут наблюдаться аналогичные зависимости, и использование индекса Икс для оценки качества культивирования в данных случаях будет оправдано.

9.1.3. Выбор клеточной тест-системы

С позиций теории мягких косметологических воздействий главным критерием оценки качества косметических средств и их ингредиентов является результат воздействия на клеточные системы кожи и, в первую очередь, на клетки базального слоя эпидермиса. Эти клетки, расположенные в верхнем слое кожи, кроме того, что не являются дифференцированными (постоянно участвуют в делении), в отличие от любых внутренних клеточных структур организма, испытывают на себе прямое действие кислорода воздуха. На наш взгляд, это обстоятельство является принципиально важным.

Известно, что в любой клеточной системе в нормальных условиях реализуется процесс ПОЛ. Каждая клетка имеет несколько уровней защиты как от развития цепного процесса, каким является ПОЛ, так, по-видимому, и от продуктов ПОЛ. На молекулярном уровне в качестве антиоксидантных веществ, блокирующих развитие процесса ПОЛ, выступают аскорбиновая кислота (витамин С), α-токоферол (витамин Е) и глутатион. К ферментам, обладающим антиоксидантным действием, относится, например, супероксиддисмутаза. Антиоксидантным действием обладают также белки, содержащие связи S-H. Так, при повышении температуры культивирования на 1-2°C многие клетки начинают синтезировать белки, названные "белками теплового шока". В структуре этих белков содержится большое число сульфгидрильных (S-H) групп. Недавно было показано [21], что клетки начинают синтезировать белки теплового шока не только при повышении температуры культивирования, но и при воздействии ионов тяжелых (переходных) металлов и УФ-облучения. Это означает, что результатом и повышения температуры культивирования, и обработки клеток микроэлементами, и УФ-облучения клеток является ПОЛ, для блокировки которого клетки синтезируют белковые антиоксиданты - белки теплового шока.

Что же касается защиты клеточных систем от образовавшихся продуктов ПОЛ (альдегидов и кетонов), то информация об этом в литературе отсутствует. В действительности для того, чтобы изучать этот вопрос, необходимо было установить наличие эффекта. Соответственно, нужно было найти критерий оценки. Наши рассуждения сводились к тому, что наиболее вероятными клеточными системами, обладающими защитой от образующихся продуктов ПОЛ, являются клетки, непосредственно контактирующие с кислородом воздуха. Как уже отмечалось ранее, такой системой являются клетки эпидермиса.

В принципе, нужно было показать, что базальные клетки эпидермиса отличаются по отношению к продуктам ПОЛ от других клеточных линий. Мы полагаем, что для этих клеток не будет наблюдаться обратная зависимость между величиной Икс на первом пассаже и значениями ростовых характеристик, усредненных по четырем пассажам (см. п.9.1.2). Таким образом, наличие или отсутствие такой зависимости, на наш взгляд, может являться критерием существования отличий клеточных культур по отношению к продуктам ПОЛ.

Однако базальные клетки эпидермиса не существуют в виде паспортизованной перевиваемой линии. Их можно было выделять в виде первичной культуры, способной выдерживать ограниченное количество пересевов (пассажей), характеризующейся постепенным снижением ростовой активности от первого к последнему пассажу. Это обстоятельство приводило бы к увеличению ошибки экспериментов и не позволяло бы делать однозначные выводы. По этой причине первичная культура базальных клеток эпидермиса оказалась неприемлемой не только для решения конкретной задачи, но возникал вопрос о возможности ее использования в качестве подходящей клеточной тест-системы для оценки качества ингредиентов косметических средств.

Одним из важнейших требований к клеточным линиям, претендующим на использование в качестве тест-систем, является их бесконечная перевиваемость и возможность культивирования в большом масштабе без существенных изменений морфологии и кариотипа, что позволяет нарабатывать необходимое количество клеток для обеспечения всех контрольно-аналитических лабораторий и исследовательских косметологических центров клеточным материалом с идентичными параметрами (номер пассажа, морфология, кариотип и т.п.)

В этой связи мы обратили свое внимание на имеющуюся в ГНЦ ВБ "Вектор" клеточную линию ЛЭЧ (легкие эмбриона человека). Эта паспортизованная стабильная перевиваемая линия фибробластов с отработанной технологией культивирования, позволяющей получать нужное количество клеточного материала с идентичными параметрами.

Клетки легких, подобно клеткам базального слоя эпидермиса, напрямую взаимодействуют с кислородом воздуха, поэтому можно было полагать, что для их существования необходимо наличие особых механизмов защиты от повреждающего воздействия продуктов ПОЛ. Из этого следует, что наблюдаемая для клеток ВНК-21 зависимость ИП1-4 от Икс для клеток ЛЭЧ должна иметь иной вид или вообще не неблюдаться.

Действительно, в ходе многочисленных экспериментов оказалось, что какая-либо зависимость ростовых характеристик клеток от количества карбонильных соединений, выделяемых клетками на первом пассаже, отсутствует.

Полученные данные свидетельствуют о том, что клеточная линия ЛЭЧ принципиально отличается от линии внутренних клеток ВНК-21 (С-13) по отношению к продуктам ПОЛ. Можно полагать, что клетки ЛЭЧ имеют особый механизм защиты от продуктов перекисного окисления. На наш взгляд, аналогичными свойствами должны обладать базальные клетки эпидермиса. Поэтому, в соответствии с теорией мягких косметологических воздействий, на данном этапе исследований, на наш взгляд, целесообразно использовать клеточную линию ЛЭЧ в качестве тест-ситсемы для оценки качества ингредиентов косметических средств.

Необходимо подчеркнуть, что попытки найти подходы к созданию тест-систем, наиболее приближенных по своим характеристикам к базальным клеткам эпидермиса (кератиноцитам), продолжаются. Например, описаны методики выращивания кератиноцитов в качестве альтернативной системы для оценки качества косметических продуктов [22]. Системы усложнялись, например, посредством введения в клеточную систему кератиноцитов таких клеток, как меланоциты и даже клеток Лангерганса [22]. При этом, из-за большой сложности культивирования клеток Лангерганса, исследователи идут на целый ряд ухищрений, в значительной степени усложняя систему (введение в питательную среду колониестимулирующего фактора макрофагов гранулоцитов, фактора некроза опухолей и т.д.). Этот прием можно назвать процедурой реконструирования эпидермиса.

Однако, как уже отмечалось ранее, ни один из приведенных вариантов клеточных систем не может рассматриваться в качестве тест-системы, так как не удовлетворяет очевидным требованиям, предъявляемым к практическим тест-системам: простота и легкость получения стандартного пула и стандартность процесса культивирования.

Остаются клетки ЛЭЧ. Но даже имея одну и ту же клеточную систему можно изучать и измерять различные параметры в качестве отклика на то или иное воздействие. Так в сообщении [24] говорится о том, что большинство известных способов выявления токсичности парфюмерно-косметических средств с использованием культур тканей млекопитающих "недостаточно эффективны, поскольку они не выявляют ранние изменения метаболизма, а регистрируют конечный этап - гибель клеток в культуре, не позволяют выявлять разную степень неблагоприятного воздействия ксенобиотиков на метаболизм клеток мишеней:" Авторы с целью обнаружения ранних этапов токсического действия ксенобиотиков на одних и тех же клетках оценивают активность ферментов в качестве индикаторов нарушения клеточных мембран (лактатдегидрогеназа) и детоксикационной защиты (ДТ-диафораза), а также уровень индуцированного перекисного окисления в качестве показателя устойчивости к стрессу на клеточном уровне.

В качестве клеточных систем авторы использовали фибробласты кожи и клетки легких эмбриона человека.

В целом подход авторов цитируемого сообщения [24] понятен. Однако возникает вопрос о том, действительно ли использование в качестве критерия токсичности и нетоксичности веществ ростовых характеристик клеточной тест-системы чем-то не устраивает токсикологов? Почему нужно стремиться к обнаружению ранних этапов токсического действия?

Давайте зададим себе вопросы. Могут ли ростовые брутто-характеристики клеточной системы не меняться в том случае, когда нарушается целостность клеточных мембран? Могут ли эти брутто-характеристики клеточных систем не зависеть от пониженной или повышенной активности фермента ДТ-диафоразы?

Ответы на эти вопросы, на наш взгляд, однозначны - при достаточно длительном воздействии токсичных веществ на клеточные культуры (например, при культивировании клеток в течение 4 - 5 пассажей) эффект должен быть обнаружен.

Теперь зададим себе вопрос о том, может ли отразиться уровень индуцированного ПОЛ на ростовых характеристиках клеточных культур?

В соответствии с проделанными нами исследованиями (см. п.9.1.2) можно полагать, что утвердительный ответ возможен для клеточных систем внутренних органов, прямо не контактирующих с кислородом воздуха. Не очень понятно, как поведут себя фибробласты кожи, расположенные в дерме, а вот для клеток ЛЭЧ такой зависимости не обнаружено (см. выше).

Но даже, если по двум критериям из трех будет наблюдаться корреляция с ростовыми характеристиками клеточной тест-системы, на наш взгляд, является целесообразным использование одного обобщающего критерия. Использование ростовых характеристик клеточной тест-системы позволит одномасштабно проранжировать брутто-эффекты разнообразных веществ, как это мы сделали при оценке предельно допустимых концентраций (Ciдоп) питательных ингредиентов (см.гл.5). В противном случае (при измерении нескольких параметров) мы вынуждены будем решать задачи следующего типа - какое вещество более токсично: то, которое увеличивает выход из клеток фермента лактатдегидрогеназы или то, которое вызывает ухудшение детоксикационной защиты клеток? Не следует также забывать, что в рамках теории мягких косметологических воздействий именно ростовая активность базальных клеток эпидермиса является определяющей в осуществлении динамического равновесного процесса формирования эпидермиса (см. гл.2).

Вне всякого сомнения, перечисленные выше и другие критерии могут быть использованы для изучения деталей механизма токсического действия.

Зададим себе еще один вопрос - может ли возникнуть такая ситуация, когда испытуемое вещество при проверке его токсичности на клеточной тест-системе в течение 4 - 5 пассажей не меняет ростовых характеристик, морфологии и кариотипа клеток, а при введении его в аналогичной концентрации в организм возникают какие-либо отклонения? На наш взгляд, с очень большой долей вероятности можно полагать, что подобная ситуация не может быть реализована.

Подозреваю, что в этом вопросе у меня найдется много оппонентов. Поэтому предлагаю сформулировать очередной парадокс. Назовём его методологическим парадоксом. Остается проверить наличие этого парадокса с помощью специально поставленных экспериментов, которые предполагают проведение многочисленных параллельных опытов как на клеточной культуре, так и на животных.

К сожалению, в настоящее время нам неизвестны попытки проранжировать качество разнообразных компонентов косметических средств на одной и той же клеточной культуре. Можно полагать, что необходимость таких исследований является неоспоримой. Так, например, на наш взгляд, чрезвычайно важной при конструировании косметических композиций является оценка действия на клеточную тест-систему различных консервирующих добавок. Решение только этого вопроса может оказать существенное влияние на безопасность косметических средств.

Совершенно очевидно, что для быстрого накопления данных в указанной области исследований необходимо решение ряда организационных вопросов, включающих:

- выбор стандартной клеточной тест-системы;

- разработка унифицированной лабораторной методики контроля, позволяющей получать сопоставимые результаты в разных лабораториях;

- бесперебойная поставка клеточных пулов в любые исследовательские лаборатории и организации;

- проведение комплексных исследований одних и тех же образцов на клеточной тест-системе и на животных.

Полагаем, что приведённые в данном разделе рассуждения и результаты некоторых экспериментов позволяют сделать выбор в пользу клеточной линии ЛЭЧ в качестве тест-системы.

Мы полагаем также, что ГНЦ ВБ "Вектор" - основной держатель музейного штамма клеток ЛЭЧ, заинтересован в поставке необходимого количества клеток по требованию любых исследовательских лабораторий и организаций. Таким образом будут созданы условия для координации исследований в указанном направлении в России и за рубежом.

Обсудим возможные ограничения применения метода контроля, основанного на применении клеточных тест-систем.

Во-первых, следует подчеркнуть, что метод пригоден для оценки качества веществ, растворимых в водных системах. При этом совершенно не обязательно, чтобы вещество растворялось в воде в значительных концентрациях. Так, в своё время, перед нами стояла задача определения растворимости в воде более 30 пространственно-затрудненных фенолов, включая токоферолацетат, ионол и т.п. Оказалось, что все они растворяются в водных системах в концентрации 10-4-10-5 М, что для токоферолацетата соответствует примерно 4 мг/л. Для многих токоферолацетат является маслорастворимым в воде продуктом. Однако и той концентрации, которую можно достичь при его растворении в воде, достаточно для того, чтобы существенным образом повлиять на функционирование клеточных систем. Однако, недавно появилось сообщение [25], свидетельствующее о том, что нерастворимые в воде вещества могут использоваться для оценки их токсичности и мутагенности в экспериментах in vitro, если они вводятся в водную систему в виде наноэмульсий. Авторам этого сообщения удалось даже определить влияние липидов на различные клеточные системы. Таким образом, ограничения, связанные с плохой растворимостью веществ в водных системах, могут быть устранены.

Во-вторых, существенное ограничение метода in vitro заключается в необходимости стерилизации исследуемых образцов, так как появление посторонней микрофлоры в процессе культивирования может отразиться на качестве клеточной тест-системы и на воспроизводимости результатов измерений. Для термостабильных веществ с целью их стерилизации можно использовать термообработку. Растворимые в водных системах образцы можно стерилизовать с помощью мембранной технологии. Этот же способ стерилизации пригоден для оценки качества готовых косметических композиций вне зависимости от типа использованной основы. При этом для желе- и гелеобразных препаратов стерилизующая фильтрация позволит отделиться от высокомолекулярных полимеров, используемых для гелеобразования, что, в общем, не противоречит процессу взаимодействия косметического средства с кожей, так как при его впитывании высокомолекулярные полимерные молекулы также остаются на поверхности и не участвуют во взаимодействии с клеточными системами кожи.

Для косметических композиций на жировой основе перед стадией стерилизующей фильтрации потребуется разрушить масляную эмульсию, добавляя, например, легко летучие органические растворители типа этилового эфира с последующим отделением водной фазы. Однако возможны и иные модификации процесса стерилизации (см. ниже).

На наш взгляд, движение в указанном направлении может привести к удивительным результатам и, по-видимому, к существенной переоценке "косметологических ценностей".

9.1.4. Изучение сырьевых ингредиентов и косметических средств с использованием клеточной линии ЛЭЧ.

В таблицах 9.9-9.12 приведены перечни растительных экстрактов, настоек, эфирных масел, отдушек, эссенций и других возможных ингредиентов косметических препаратов, изученных с помощью клеточной тест-системы ЛЭЧ в сопоставимых условиях.

Таблица 9.9 Перечень растительных экстрактов и настоек, изученных*) с помощью клеточной тест-системы

п/п
Наименование (номенклатурный номер) Производство Примечание
1. Аралия Нижегородский завод лекарственных препаратов "Фитофарм-НН" Корни
2. Бадан ООО "Живая косметика Сибири" Корни
3. Боярышник ЗАО "Алтайвитамины", г.Бийск Ягоды
4. Брусника ООО "Живая косметика Сибири" Листья
5. Валериана ОАО "Фармацевтическая фабрика", г.Новосибирск Корни
6. Василек ООО "Живая косметика Сибири" Цветы
7. Гравилат ООО "Живая косметика Сибири" Корни
8. Гравилат ООО "Живая косметика Сибири" Листья
9. Донник ООО "Живая косметика Сибири" Трава с соцветиями
10. Душица ООО "Живая косметика Сибири" Трава с соцветиями
11. Ель ООО "Живая косметика Сибири" Лапка
12. Зверобой ЗАО "Эвалар", г.Бийск  
13. Ива ООО "Живая косметика Сибири" Кора
14. Календула Нижегородский завод лекарственных препаратов "Фитофарм-НН" Цветы
15. Калина ООО "Живая косметика Сибири" Ягоды
16. Клевер ООО "Живая косметика Сибири" Цветы
17. Крапива АООТ "Тверская фармацевтическая фабрика" Листья
18. Левзея Ай Си Эн Томскхимфарм Корни
19. Лимонник ОАО "Фармацевтическая фабрика Санкт-Петербурга" Ягоды
20. Лопух ООО "Живая косметика Сибири" Листья
21. Льнянка ООО "Живая косметика Сибири" Цветы
22. Мать-и-мачеха ООО "Живая косметика Сибири" Листья
23. Мята перечная ОАО "Московская фармацевтическая фабрика" Листья
24. Пион уклоняющийся ОАО "Юнифарм", г.Барнаул Корни
25. Пихта, водный экстракт Горно-химический комбинат, г.Железногорск Лапка
26. Полынь ОАО "Краснодарская фармацевтическая фабрика", г.Краснодар Трава
27. Прополис ОАО "Московская фармацевтическая фабрика"  
28. Пырей ползучий ООО "Живая косметика Сибири" Корни
29. Родиола ООО "Камелия НПП", г.Москва Корни
30. Ромашка аптечная ООО "Живая косметика Сибири" Цветы
31. Ромашка душистая ООО "Живая косметика Сибири" Цветы
32. Ротокан ОАО "Московская фармацевтическая фабрика"  
33. Сельдерей "Гиорд-Пищевик"  
34. Смородина ООО "Живая косметика Сибири" Листья
35. Спорыш ООО "Живая косметика Сибири"  
36. Тысячелистник ООО "Живая косметика Сибири" Трава с соцветиями
37. Хвощ зимующий ООО "Живая косметика Сибири" Растение
38. Хвощ полевой ООО "Живая косметика Сибири" Растение
39. Хрен ООО "Живая косметика Сибири" Корни
40. Цикорий ООО "Живая косметика Сибири" Корни
41. Чага АООТ "Тверская фармацевтическая фабрика"  
42. Череда ООО "Живая косметика Сибири" Трава
43. Черёмуха ООО "Живая косметика Сибири" Листья
44. Щавель ООО "Живая косметика Сибири" Листья
45. Эвкалипт ОАО "Фармацевтическая фабрика", г.Новосибирск Листья
46. Элеутерококк ОАО "Дальхимфарм", г.Хабаровск  


*) Здесь и далее результаты принадлежат фирмам, предоставившим образцы для исследования и Научно-производственному центру "Сибирская природная косметика"


Таблица 9.10 Перечень эфирных масел, изученных с помощью клеточной тест-системы


п/п
Наименование (номенклатурный номер) Производство Примечание
1. (SA102622) R.C.TREATT Co Ltd Cedar leaf
2. (SA102634) R.C.TREATT Co Ltd Tarragon
3. (SA102635) R.C.TREATT Co Ltd Thyme
4. (SA102636) R.C.TREATT Co Ltd Worm Wood
5. Анисовое "Гиорд-Пищевик"  
6. Апельсиновое "Гиорд-Пищевик"  
7. Апельсиновое (SA102629) R.C.TREATT Co Ltd Orange
8. Бергамотное "Гиорд-Пищевик"  
9. Гвоздичное "Гиорд-Пищевик"  
10. Гераневое "Гиорд-Пищевик"  
11. Гераниевое Производитель не найден  
12. Грейпфрутовое "Гиорд-Пищевик"  
13. Еловой хвои ООО "Туше флора"  
14. Иланг-иланговое "Гиорд-Пищевик"  
15. Кардамоновое "Гиорд-Пищевик"  
16. Кедровое (атлас.) ООО "Туше флора"  
17. Кедрового дерева (кит.) ООО "Туше флора"  
18. Кедрово-стланниковое Дальневосточный НИИ лесного хозяйства  
19. Коричное "Гиорд-Пищевик"  
20. Лавандовое "Гиорд-Пищевик"  
21. Лавандовое (Мон Блан) ООО "Туше флора"  
22. Лавандовое Производитель не определен  
23. Лавровое "Гиорд-Пищевик"  
24. Ладановое "Гиорд-Пищевик"  
25. Лимонное "Гиорд-Пищевик"  
26. Лимонное Производитель не найден  
27. Лимонное (SA102627) R.C.TREATT Co Ltd Lemon
28. Мандариновое "Гиорд-Пищевик"  
29. Мандариновое Экспериментальный образец, г.Красноярск  
30. Мандариновое (SA102628) R.C.TREATT Co Ltd Mandarin
31. Миндальное "Гиорд-Пищевик"  
32. Можжевеловое "Гиорд-Пищевик"  
33. Мускатное "Гиорд-Пищевик"  
34. Мускатный орех "Гиорд-Пищевик"  
35. Мятное "Гиорд-Пищевик"  
36. Мятное Фабрика галеновых препаратов, г.Новосибирск Повышенное содержание ментола
37. Мяты перечной (SA102631) R.C.TREATT Co Ltd Peppermint
38. Пачулиевое "Гиорд-Пищевик"  
39. Перолиевое "Гиорд-Пищевик"  
40. Петрушки масло (SA102630) R.C.TREATT Co Ltd Parsly
41. Пихтовое З-д "Фитопрепаратов", г.Новосибирск СО2-экстракт
42. Пихтовое Горно-химический комбинат, г.Железногорск СО2-экстракт
43. Полыни обыкновенной ООО "Туше флора"  
44. Померанцевое "Гиорд-Пищевик"  
45. Розмариновое "Гиорд-Пищевик"  
46. Розмариновое (испан.) ООО "Туше флора"  
47. Розовое "Гиорд-Пищевик"  
48. Розовое Производитель не определен  
49. Семян моркови (SA102621) R.C.TREATT Co Ltd Carrot seed
50. Семян сельдерея (SA102623) R.C.TREATT Co Ltd Celery seed
51. Сосновой хвои (SA102632) R.C.TREATT Co Ltd Pine Needle
52. Тминовое "Гиорд-Пищевик"  
53. Тминовое (SA102619) R.C.TREATT Co Ltd Caraway
54. Тминовое (SA102620) R.C.TREATT Co Ltd Caraway
55. Туи ООО "Туше флора"  
56. Укропное "Гиорд-Пищевик"  
57. Чайного дерева "Гиорд-Пищевик"  
58. Чайного дерева ООО "Туше флора"  
59. Чесночное (SA102626) R.C.TREATT Co Ltd Garlic
60. Шалфейное "Гиорд-Пищевик"  
61. Шалфейное (SA102633) R.C.TREATT Co Ltd Sage
62. Шалфея очищенного (SA102624) R.C.TREATT Co Ltd Clary Sage
63. Эвкалиптовое "Гиорд-Пищевик"  
64. Эвкалиптовое (кит., 80/85%) ООО "Туше флора"  
65. Эвкалиптовое (австрал., 80/85%) ООО "Туше флора"  
66. Эвкалиптовое (SA102625) R.C.TREATT Co Ltd Eucalyptus

Таблица 9.11 Перечень отдушек, изученных с помощью клеточной тест-системы


п/п
Наименование Технические условия (поставщик) Примечание
1. Ананасная отдушка ОСТ 18-103-84  
2. Цветочная отдушка ТУ 64-19-149-92  
3. Цитрусовая отдушка ТУ 64-19-149-92  
4. Манговая отдушка ОСТ 18-103-84  
5. Медовая отдушка ОСТ 18-103-84  
6. Шоколадная отдушка Поставщик не определен  
7. Персиковая отдушка Поставщик не определен  
8. Шалфей мускатный (отдушка) АО "Ника" (г.Бишкек)  
9. Ананасная эссенция ОСТ 18-103-84  
10. Грушевая эссенция ОСТ 18-103-84  
11. Пуншевая эссенция ОСТ 18-103-84  

Таблица 9.12 Перечень препаратов фирмы JSP Europe, изученных с помощью клеточной тест-системы.


п/п
Наименование Действующие вещества Назначение
1. Escalol 577 Бензофенон-4 Защита от солнечных лучей
2. Escalol 567 Бензофенон-3 Защита от солнечных лучей
3. Germall 115 Имидазолидинил мочевина Биоцид (консервант)
4. Germall II Диазолидинил мочевина Биоцид (консервант)
5. Allantoin Глиоксилдиурид Защита кожи от раздражения
6. Germaben II-E Диазолидинил мочевина - 20%;
Метилпарабен - 10%;
Пропилпарабен - 10%;
Пропиленгликоль - 60%.
Биоцидная (консервирующая) смесь
7. Liqnapar PE Феноксиэтанол - 65-70%;
Изопропилпарабен - 11-13%;
Изобутилпарабен - 9-11%;
н-Бутилпарабен - 9-11%.
Биоцидная (консервирующая) смесь
8. Suttocide A Гидроксиметилглицинат натрия Биоцид (консервант)
9. Surfadone LP-100 н-Октилпирролидон Загуститель и стабилизатор пены
10. Surfadone LP-300 н-Додецилпирролидон Загуститель и стабилизатор пены
11. Germaben II Диазолидинил мочевина-30%;
Метилпарабен - 11%;
Пропилпарабен - 31%;
Пропиленгликоль - 56%.
Биоцидная (консервирующая) смесь
12. Escalol 507 Октилдиметил-пара-аминобензойная кислота Защита от солнечных лучей
13. Liquid Germall Plus Диазолидинил мочевина - 39,6%;
Иодопропинилбутилкарбамат - 0,4%;
Пропиленгликоль - 60%.
Биоцидная (консервирующая) смесь

В качестве примера использования клеточной линии могут служить наши исследования по оценке относительной токсичности спиртовых растительных настоек, экстрактов (46 образцов), эфирных масел (66 образцов), а также отдушек, эссенций (11 образцов) и других ингредиентов. Полученные результаты свидетельствуют о том, что препараты одного наименования, полученные от разных производителей (поставщиков), могут отличаться существенным образом. Так, например, образец эфирного масла апельсина, предоставленный фирмой "Гиорд-Пищевик", характеризуется отношением ИП0/ИПк=0,75, в то время как для аналогичного эфирного масла (Orange, SA 102629), предоставленного фирмой R.C.TREATT Co Ltd, эта величина равняется 0,1. С учетом точности определения (±20%) наблюдаемые различия следует считать достоверными.

Имея перед собой всю совокупность полученных данных, мы не смогли удержаться от следующего вполне логичного шага. Ведь, если методика позволяет оценивать относительную токсичность и определять допустимые концентрации ингредиентов, включаемых в косметические препараты, то почему бы не использовать ее для оценки относительного влияния на клеточную линию готовых косметических композиций. Фактически мы приблизились к решению основных вопросов практической косметологии. Действительно ли создаваемые разработчиками косметических средств препараты имеют сбалансированные составы? Не нагружаем ли мы разрабатываемые композиции в угоду более высокой микробиологической устойчивости препаратов излишне высокими концентрациями биоцидных добавок? Или еще проще - всегда ли соблюдается на клеточном уровне известный принцип "не навреди"?

Отчетливо понимая всю этическую "скользкость" предпринятых нами экспериментов мы не приводим точные названия кремовых композиций и, собственно, фирм-производителей. Однако для того, чтобы читателю убедиться в реальности изученных средств, вынуждены представить перечни ингредиентов, приводимых разработчиками в описаниях составов препаратов. Выбор образцов косметических средств в большинстве своем был совершенно случайным. Полученные данные приведены в таблице 9.13 (очень неудобный номер).

Таблица 9.13 Результаты оценки относительной токсичности некоторых косметических препаратов с использованием клеточной тест-системы


п/п

Название, назначение

Перечень ингредиентов*)

Результаты измерений**)

Примеча-ния

Вариант А

Вариант Б

1. Гель для массажа Вода      
Изопропилмиристат

0

0

 

Масло чайного дерева

0

0

 

Масло эвкалиптовое

 

 

 

ПЭГ-40

 

 

 

Гидрогенизированное касторовое масло

 

 

 

Карбомер

 

 

 

Камфора

 

 

 

Ментол

 

 

 

Метилсалицилат

 

 

 

Этанол

 

 

 

2-Бром-2-нитропропан-1,3-диол

 

 

 

2. Гель для рук Вода

 

 

 

Глицерин

1.0

1.13

 

ПЭГ-40

0.95

1.00

 

Гидрогенизированное касторовое масло

 

 

 

Экстракт ромашки

 

 

 

Карбомер

 

 

 

Парфюмерная композиция

 

 

 

Триэтаноламин

 

 

 

2-Бром-2-нитропропан-1,3-диол

 

 

 

С.1.74180

 

 

 

3. Крем питательный для лица Вода

 

 

 

Масло соевое

0.53

0

 

Эмульсионный воск

0.62

0

 

Глицерин

 

 

 

Стеарин

 

 

 

Ланолин

 

 

 

Цетеариловый спирт

 

 

 

Глицирил стеарат

 

 

 

Экстракт овса

 

 

 

Триэтаноламин

 

 

 

Метилпарабен

 

 

 

Пропилпарабен

 

 

 

2-Бром-2-нитропропан-1,3-диол

 

 

 

Парфюмерная композиция

 

 

 

4. Крем дневной Вода

0.63

0.88

 

Растительное масло

0.51

0

 

Глицерин

 

 

 

Глицерил стеарат

 

 

 

Воск эмульсионный

 

 

 

Стеарин

 

 

 

Спирт этиловый

 

 

 

Триэтаноламин

 

 

 

Парфюмерная композиция

 

 

 

Метилпарабен

 

 

 

2-Бром-2-нитропропан-1,3-диол

 

 

 

Экстракт женьшеня

 

 

 

5. Увлажняющий гель Вода

 

 

 

Пропиленгликоль

0

0

 

Пантенол (провитамин В5)

 

 

 

Экстракт алоэ-вера

 

 

 

Экстакт календулы

 

 

 

Гидрокомплекс

 

 

 

Карбомер

 

 

 

Метилпарабен

 

 

 

Пропилпарабен

 

 

 

Бронопол

 

 

 

Парфюмерная композиция

 

 

 

6. Крем молодёжный (вечерний) до 20-25 лет Гель полиэтиленоксида

0.81

0.81

 

Комплекс неорганических солей (Na, K, Ca, Mg)

0.98

0.98

 

Отвар корней бадана

 

 

 

Отвар корней дуба

 

 

 

Глицерин

 

 

 

Бензоат натрия

 

 

 

Эссенция грушевая

 

 

 

Настойка подорожника

 

 

 

Настойка листьев черёмухи

 

 

 

Лимонная кислота

 

 

 

7. Система Подтягивающая от 30-35 лет и старше Яичные белки

1.22

0.68

 

Комплекс неорганических солей (Na, K, Ca, Mg)

0.82

0.85

 

Бензоат натрия

 

 

 

Глюкоза

 

 

 

Глицерин

 

 

 

Масло зародышей пшеницы

 

 

 

Ромовая эссенция

 

 

 

Масло розовое

 

 

 

Настойка листьев смородины

 

 

 

Яичные желтки

 

 

 

8. Крем регенери-рующий от 30-35 лет и старше Гель полиэтиленоксида

0.75

0.75

 

Комплекс неорганических солей (Na, K, Ca, Mg)

 

 

 

Гонады асцидий

 

 

 

Глицерин

 

 

 

Глюкоза

 

 

 

Аминокислотно-витаминный комплекс (14 аминокислот + 8 витаминов)

 

 

 

Масло зародышей пшеницы

 

 

 

Масло лаванды

 

 

 

Настойка водорослей

 

 

 

Яичные желтки

 

 

 

Бензоат натрия

 

 

 

9. Система отбеливающая Гель полиэтиленоксида

1.13

1.13

 

Комплекс неорганических солей (Na, K, Ca, Mg)

0.87

1.00

 

Глицерин

 

 

 

Сок капусты

 

 

 

Детрит бифидумбактерий

 

 

 

Настойка подорожника

 

 

 

Настойка листьев смородины

 

 

 

Сок лимона

 

 

 

Сок хрена

 

 

 

Бензоат натрия

 

 

 

Облепиховое масло

 

 

 

Масло зародышей пшеницы

 

 

 

Отдушка "Манго"

 

 

 

10. Крем питательный Гель полиэтиленоксида

0.88

1.06

 

Комплекс неорганических солей (Na, K, Ca, Mg)

1.08

0.95

 

Глицерин

 

 

 

Глюкоза

 

 

 

Аминокислотно-витаминный комплекс (14 аминокислот + 8 витаминов)

 

 

 

Масло зародышей пшеницы

 

 

 

Настойка подорожника

 

 

 

Настойка листьев смородины

 

 

 

Яичные желтки

 

 

 

Отдушка цитрусовая

 

 

 

11. Normalizing lotion for oily skins Water

 

 

 

Alge barbadensis extract

0

0

 

Hydrolyzed milk protein

 

 

 

Propylene glycol

 

 

 

Sage (Salvia officinalis/extract

 

 

 

Honey (Mel) extract

 

 

 

Quaternium 26

 

 

 

Polysorbate 20

 

 

 

Fragrance (parfum)

 

 

 

Sodium methylparabene

 

 

 

Methenamine

 

 

 

EDTA

 

 

 

Acid red 14 (Cl 14720)

 

 

 

Acid yellow 23 (Cl 19140)

 

 

 

Brilliant black 1 (Cl 28440)

 

 

 

12. Oxygenating and stimulating day cream - all skins Water

 

 

 

Honey (Mel) extract

 

 

 

Isodecyl isononanoate

0.26

0

 

Corn (zeamays) oil

 

 

 

Stearyl dimeticone

 

 

 

Polymethylmethacrylate

 

 

 

Yeast (faex) extract

 

 

 

Glycerin

 

 

 

Propylene glycol

 

 

 

Perfluoropolymethhy-lisopropyl ester

 

 

 

Polyglyceryl isostearate

 

 

 

Cethyl dimethicone copolyol

 

 

 

Hexyl laurate

 

 

 

Titanium dioxide

 

 

 

Hydrogenated rice bran wax

 

 

 

Magnesium sulfate

 

 

 

Mannitol

 

 

 

Glycosphingolipids

 

 

 

Tocopheryl acetate

 

 

 

Lecithin

 

 

 

Reg 36 cactor oil

 

 

 

Cholesterol

 

 

 

Sclerotium gum

 

 

 

Fragrance (parfum)

 

 

 

Phenoxyethanol

 

 

 

Chloronenesin

 

 

 

Methylparabene

 

 

 

Polyacrylamide

 

 

 

Buthylparabene

 

 

 

Sorbic acid

 

 

 

C13-14-isoparaffin

 

 

 

Laureth 7

 

 

 

13. Apricot mask normal skins Water

 

 

 

Polysorbate 20

 

 

 

Propylene glycol

 

 

 

Acrylates/steareth-20 methacrylate copolymer

0,87 (требу-ется повтор)

Пока не опреде-лено

 

Fragrance (parfum)

 

 

 

Triethanolamine

 

 

 

Sodium methylparabene

 

 

 

Methenamine

 

 

 

EDTAAcid red (Cl 14720)

 

 

 

FD and Yellow №5 (Cl 19140)

 

 

 

14. Phyto-peeling with seeweeds, new formula - all skins Water

 

 

 

Cellulose

 

 

 

DATT (Avena Sativa)

0

0

 

Fluor

 

 

 

Clyceryl stearate SE

 

 

 

Isopropyl myristate

 

 

 

Sorbitol

 

 

 

Cetearyl octanoate

 

 

 

Titanium dioxide

 

 

 

Mineral oil (paraffinium liquidum)

 

 

 

Glyceryl stearate

 

 

 

Peg 100 stearate

 

 

 

Algin

 

 

 

Calcium sulfate

 

 

 

Tetrasodium pyrophosphate

 

 

 

Diatomaceous earth (solum diatomeal)

 

 

 

Reg 2 stearate

 

 

 

Myristyl lactate

 

 

 

Polyethylene

 

 

 

Lanolin alcohol (Lanolin)

 

 

 

Hexamidine diisethionate

 

 

 

2-Bromo-2-nitropropane-1,3-diol

 

 

 

Propylparabene

 

 

 

Methyldibromoglutaronitrile

 

 

 

Phenoxyethanol

 

 

 

Propylene glycol

 

 

 

Methylchloro-isothiazolinone

 

 

 

Methylisothiazolinone

 

 

 

Aluminium oxide

 

 

 

D and C Red №30 (Cl 73360)

 

 

 

15. Line-blossom mask dry and sensitive skins Water

 

 

 

Propylene glycol

 

 

 

Isopropyl miristate

0

0

 

Ceteareth-6

 

 

 

Stearyl alcohol

 

 

 

Glycerin

 

 

 

Titanium dioxide

 

 

 

Kaolin

 

 

 

Sunflower (helianthus, annuus) seed oil

 

 

 

Cyclomethicone

 

 

 

Aloe barbadensis extract

 

 

 

Linden (Tilia platyphyllos)

 

 

 

Fragrance (parfum)

 

 

 

Methylparabene

 

 

 

Hexamidine diisethionaate

 

 

 

2-Bromo-2-nitropropan-1,3-diol

 

 

 

Dehydroacetic acid

 

 

 

Propylparabene

 

 

 

FD and C yellow №5 (Cl19140)

 

 

 

Acid blue 1 (CL 42045)

 

 

 

*) Перечень ингредиентов приведен в произвольном порядке.
**) Предварительная подготовка образцов включала смешивание навески кремовой композиции и 96% этилового спирта с интенсивным периодическим встряхиванием в течение 48 часов.

Результаты измерений представлены в виде отношений ИПon/ИПk(cn), где ИПon и ИПk(cn) являются индексом пролиферации клеточной системы в присутствии спиртового экстракта кремовой композиции и в присутствии эквивалентного количества этилового спирта, соответственно.

Индексы пролиферации представляют отношение количества клеток в конце эксперимента к исходному количеству посеянных клеток. Точность определения - ±20%.

Вариант А предусматривает введение спиртового экстракта кремовой композиции (опыт) или этилового спирта (контроль) к ростовой питательной среде в количестве 5%, выдерживание клеток в этих системах в течение 3 часов, промывку клеток ростовой средой и последующую их "разгонку" в свежей ростовой среде в течение 24 часов.

Вариант Б предусматривает увеличение концентрации спиртовых экстрактов (опыт) или этилового спирта (контроль) до 10% и уменьшение длительности воздействия на клетки до 1,5 часа. Остальные условия аналогичны варианту А.

Дополнительным контролем, характеризующим состояние клеточной системы, служили эксперименты, в которых исходный клеточный пул выдерживался в ростовой питательной среде, не содержащей каких-либо добавок (ИПк).

На данном этапе из-за небольшого количества образцов и проведенных экспериментов можно оставить полученные результаты без комментариев. Однако надеемся, что они послужат отправной точкой для серьезных размышлений.

Действительно, если экстракт, полученный из косметического средства, способен уничтожать клеточный пул, моделирующий клетки базального слоя кожи, то весьма высока вероятность того, что динамическое равновесие процессов формирования эпидермиса будет нарушаться в сторону увеличения толщины рогового слоя. А это, при регулярном использовании подобных косметических средств, может вести к ускорению образования морщин, то есть - к старению кожи (см. гл. 2). В соответствии с теорией мягких косметологических воздействий отрицательные нагрузки такого рода на клеточные системы кожи должны исключаться из арсенала косметологов и потребителей косметики.

Работа в указанном направлении продолжается. Обсуждается возможность создания специализированной цитологической лаборатории, основной целью которой являлась бы детальная отработка и сертификация представленной методики. Но уже сейчас полученные результаты позволяют, на наш взгляд, подойти к осознанному конструированию косметических композиций, в достаточной степени безопасных для потребителей.

Надеюсь, что серьезный читатель не обидится на отдельные "всплески" этического характера, проскальзывающие в некоторых разделах представляемой монографии. Так, полученные результаты кажутся настолько серьезными, что, на наш взгляд, необходимо провести срочную ревизию всех косметических препаратов, присутствующих на нашем рынке. Однако, зная состояние научной косметологии можно полагать, что очереди на проверку безопасности препаратов среди разработчиков, в ближайшие годы наблюдаться не будет.

Заинтересоваться методикой, на наш взгляд, смогут только отдельные очень ответственные фирмы-производители косметических средств. Возможно, все остальные будут ждать ее официальной сертификации. Чем не этическая проблема! Что же касается официальных органов сертификации РФ, то можно полагать, что отсутствие средств для организации соответствующей лаборатории и последующего внедрения методики в работу сертификационных центров не позволит им реально приступить к реализации проекта.

Как бы там ни было, но нам кажется удалось установить (зафиксировать) несколько ранее не учитываемых параметров, превращающих цитологическую методику контроля в достаточно стандартную операцию, позволяющую получать достаточно сопоставимые результаты, не зависящие от места и времени проведения экспериментов.

9.1.5. Некоторые примеры использования клеточной культуры Vero для оценки цитотоксичности.

Как следует из всего вышеизложенного, клеточная линия ЛЭЧ предназначена для оценки влияния косметических средств и ингредиентов, входящих в их состав, на клеточные системы кожи, непосредственно контактирующие с кислородом воздуха (клетки эпидермиса). В свою очередь, для оценки влияния веществ на внутренние клеточные системы организма обычно используют перевиваемую клеточную культуру Vero. Отклик этих клеток, являющихся фибробластами, выделенными из почки зеленой мартышки, на разнообразные воздействия может быть адекватен реакции на них и других клеток внутренних органов.

Так как вопросы оценки качества косметических препаратов в процессе развития промышленной косметологии (их влияния на организм в целом) и в связи с наблюдаемым увеличением количества поддельной (контрафактной) продукции, приобретают особое значение. Поэтому была создана Лаборатория научной косметологии Научного косметологического общества, которая выполняет заказы потребителей, разработчиков и распространителей (работников торговли) по оценке качества косметических средств с использованием стандартной общепринятой клеточной системы Vero. Следует отметить, что использованная методика, кроме оценки цитотоксичности препаратов, позволяет определять и их противовирусную активность. Это обстоятельство является важным, так как некоторые виды патологических процессов в коже могут инициироваться с участием вирусных частиц.

Ниже приводятся результаты подобного исследования, выполненного по специальному заказу частного лица и одной из фирм - производителей косметических средств, и краткое описание использованных методик.

Оценка цитопатической и противовирусной активности - в качестве клеточной тест - системы использовалась перевиваемая культура клеток почки зеленой мартышки (Vero). Клетки высевались в ростовую, питательную среду в ячейки пластмассовых планшетов и через 2-3 суток образовывали на дне ячеек плотный слой. Затем в ячейки добавляли спиртовые экстракты испытуемых образцов в различных концентрациях и суспензию частиц вируса осповакцины (poxvirus) и выдерживали в термостате в течение 96 часов. К определенной части ячеек вирусную суспензию не добавляли. Они служили в качестве контрольных точек для расчетов статистически достоверных значений предельно допустимых концентраций, определяемых по величинам ТС50, которые соответствуют концентрациям добавляемых образцов, при которых наблюдается 50% гибель клеточного пула.

Влияние вируса на клеточную культуру (с добавками испытуемх образцов) оценивали по величинам IC50, представляющим концентрации добавляемых образцов, при которых наблюдалась защита клеток от патогенного действия вирусных частиц (50% от общей величины защиты).

Описание изученных препаратов

Господин Tan Weiping передал нам для изучения свойств, три образца косметики швейцарской дистрибьюторской фирмы "My Lexxus Europe"; товарный знак - Skindulgence; серия - Facelift system (произведено в США - отсутствует название фирмы-производителя):

А) маска (Masque - Tenseur "2");

Б) увлажняющий крем (Creme Hydratante);

В) очищающее молочко (Lait Nettoyant).

Особый интерес для нас представляли результаты экспериментальной оценки цитопатической и противовирусной активности представленных образцов в сопоставлении с препаратами четвертого поколения (ИПСО Системы), выпускаемыми ООО "Живая косметика Сибири" по разработкам Научного косметологического общества (см. таблицу). Эти исследования были инициированы руководством фирмы.

Использованная нами методика подготовки образцов для анализа включала разбавление препаратов этиловым спиртом в весовом соотношении препарат : спирт = 1 : 2.87-3.27, встряхивание полученных смесей, отстаивание и отбор проб.

Т а б л и ц а Цитопатическая и противовирусная активность некоторых косметических средств

Цитопатическая и противовирусная активность некоторых косметических средств

*) Значения ТС50 5 характеризуют только цитотоксичность этилового спирта, который использовался в качестве растворителя для извлечения активных ингредиентов косметических средств.

Полученные результаты свидетельствуют о наличии существенной токсичности в двух образцах фирмы "My Lexxus Europe". В свою очередь, препараты IV поколения (ИПСО Системы) и их кремовая основа - гель полиэтиленоксида являются нетоксичными. Более того, впервые показано, что ИПСО Система (молодежная) и ИПСО Система (отбеливающая) обладают способностью блокировать развитие вирусов в клеточных системах.

9.2. Коллагеновый путь старения кожи

Широкое распространение получила гипотеза о том, что полипептидные цепи коллагена в старческом возрасте имеют повышенное содержание сшивок. Наблюдения, лежащие в основе этой гипотезы, привели к созданию коллагеновой теории старения [26]. В соответствии с теорией, накопление числа ковалентных сшивок в коллагене при увеличении возраста животного переводит белок в нерастворимое состояние. Вследствие чего он накапливается в тканях в ущерб клеткам, вызывая нарушение в функционировании органов и всего организма. Не вдаваясь в детали этой теории на уровне организма в целом, рассмотрим некоторые детали строения коллагеновых фибрилл и их взаимопревращения в коже животных.

Однако предварительно следует заметить, что причиной сшивок в молекуле коллагена могут быть совершенно разные химические процессы. Так, образование поперечных сшивок в коллагеновых фибриллах возможно за счёт модификации оксилизиновых остатков исходных α-цепей с участием такого внеклеточного фермента как лизилоксидаза. Образованные таким образом поперечные сшивки могут иметь тип лизинонорлейцина (-(СН2)4-NH-(CH2)4) или оксилизинонорлейцина (-(СH2)4-NH-CH2-CHOH-(CH2)2). Кроме этого, возможно появление сшивок за счёт образования связей S-S между цепями с участием цистеиновых остатков, которые присутствуют в молекулах коллагена любого типа. Следует также напомнить о возможности возникновения сшивок за счёт взаимодействия белковых молекул с продуктами ПОЛ (см. рис.9.3). Поэтому можно полагать, что и отношение вновь возникающих связей такого рода к внешним воздействиям будет различным. По-видимому, различным будет и участие этих связей в модификации общей структуры белка.

9.2.1. Строение коллагена

Коллагеновые фибриллы состоят из мономеров (скорее из отрезков), а каждый отрезок представляет собой три полипептидные цепи, свернутые относительно друг друга в виде спирали. Полипептидные цепи имеют несколько вариантов строения: α1(I), α1(II), α1(III), α1(IV) и, аналогично, варианты цепей α2, которые отличаются последовательностью аминокислот и поэтому, по-видимому, их синтез кодируются разными генами. Каждая α-цепь состоит приблизительно из 1050 аминокислот и имеет молекулярную массу около 100 кDа. Центральная часть α-цепи состоит из примерно 1000 аминокислотных фрагментов, соединённых через чередующиеся последовательности Гли-x-y. Таким образом, глициновый фрагмент занимает каждое третье положение в цепи. У глицина нет боковых заместителей - это самая маленькая (по размеру) аминокислота. Азот аминогруппы глицина одной цепи связан водородной связью с карбонильным кислородом глицина другой цепи. И таких водородных связей между тремя свитыми в спираль цепями может быть образовано более 600. Несмотря на то, что энергия таких связей составляет всего 3-5 ккал/моль, существование большого числа индивидуальных связей (две связи на три пептидные цепи) обеспечивают прочное удерживание трёх цепей в спиралевидном состоянии.

Остальные два положения "X" и "Y" в упоминаемой выше триаде Гли-x-y, могут занимать другие аминокислоты. Часто встречаются пролин и гидроксипролин. Чем выше суммарное содержание пролина и гидроксипролина, тем выше стабильность и температура плавления. Так, коллаген в коже телёнка содержит 232 фрагмента этих аминокислот, и температура его плавления равняется 39°C, в то время как коллаген кожи трески содержит 155 фрагментов пролина и гидроксипролина, что приводит к снижению температуры плавления коллагена до 16°C. Следует также подчеркнуть, что не только суммарное количество пролина и гидроксипролина определяет стабильность коллагена, но и соотношение указанных аминокислот в его молекуле. Так коллаген, в котором содержится только пролин, имеет температуру плавления в интервале от 20 до 25°C. Если же вместо пролина содержится гидроксипролин, температура плавления повышается до 37°C. Эти изменения объясняются возможностью гидроксипролинового фрагмента образовывать дополнительные водородные связи. Таким образом, сформулированный отрезок (проколлаген), состоящий из трёх пептидов, скрученных в спираль, сшивается с другими аналогичными отрезками, образуя коллагеновую фибриллу.

Коллагеновые фибриллы, в зависимости от места локализации в организме и от возраста, имеют разное строение. Например, кожа зародыша содержит больше коллагена типа III, чем типа I, а у взрослых это соотношение меняется на обратное.

9.2.2. Изменения строения коллагена, связанные с возрастом

Отдельные фрагменты коллагеновых фибрилл диссоциируют в щелочных или кислых растворах, а также в растворах мочевины, тиоцианата и гуанидингидрохлорида. При нагревании до 40°C водородные связи между пептидными цепями разрушаются, и часть коллагена переходит в раствор. Этим обстоятельством пользуются для оценки соотношения количества нативного (растворимого) и сшитого (нерастворимого) коллагена, так как при наличии поперечных ковалентных сшивок в структуре коллагена переход его фрагментов в раствор оказывается затруднённым, а в пределе и невозможным.

Имеются отчётливые экспериментальные подтверждения того обстоятельства, что в процессе старения организма в коже снижается содержание растворимого с одновременным повышением содержания нерастворимого коллагена. Так, при экстракции водным солевым раствором из кожи крыс возрастом от 1,5 до 24 месяцев обнаружено, что количество экстрагируемых одиночных α-цепей с возрастом быстро уменьшалось, а количество тримеров α-цепей увеличивалось, а вот количество димеров во всех возрастных группах оставалось постоянным. Одновременно с этим неуклонно нарастало количество нерастворимого коллагена (см. рис.9.6)

Рисунок 9.6 Изменение с возрастом суммарного содержания различных видов коллагена в сухожилии хвоста крысы (по данным работы [27])

Изменение с возрастом суммарного содержания различных видов коллагена в сухожилии хвоста крысы (по данным работы [27])

Результаты экспериментов, представленные на рис.9.6, также однозначно свидетельствуют о протекании процессов, ведущих к образованию сшивок между индивидуальными α-пептидными цепями в молекуле коллагена.

Однако имеются и другие сведения. При измерении числа сшивок в сухожилии коров трёх- и двенадцатилетнего возраста после расщепления коллагена цианогенбромидом никакой разницы в количестве ковалентных сшивок не обнаружили [28]. С другой стороны, было показано, что число сшивок, образованных пиридинолином, в коллагене рёберных связок и ахиллесова сухожилия крыс после наступления зрелости растёт, а у человека после 30 лет - снижается [29]. А вот один из основных типов сшивок в коже - оксилизинонорлейциновый с возрастом не меняется [30]. На основании этих данных можно было бы прийти к выводу о том, что образование поперечных сшивок в коллагене не является первичной причиной старения. Однако все эти исследования относятся к вполне определённым видам поперечных сшивок и не учитывают возможность изменения структуры коллагеновых фибрилл, например, за счёт модификации поверхности молекулы коллагена и/или посредством межфибрилльных сшивок, протекающих в ходе взаимодействия с высокореакционноспособными продуктами ПОЛ.

Поэтому, на наш взгляд, для дальнейших рассуждений нет необходимости в сопоставлении весьма неоднородного массива экспериментальных данных. Например, как сопоставить данные о количестве поперечных сшивок в сухожилии коров после расщепления коллагена цианогенбромидом с результатами, полученными посредством экстракции коллагена из кожи крыс солевым раствором.

Предлагаем принять за основу приведённые выше данные о том, что в процессе старения организма в коллагене увеличивается количество сшивок.

9.2.3. Изменение содержания количества коллагена в коже животных в процессе старения

Возвращаясь к рассмотрению графика, представленного на рис.9.6, отметим, что в сухожилии хвоста крыс в процессе старения общее количество коллагена возрастает. Однако это обстоятельство находится в противоречии с более поздними данными [31] и с широко распространённым среди косметологов-профессионалов мнением о том, что общее количество коллагена в коже в процессе старения наоборот снижается. Так в работе [31] в графическом виде (см. рис.9.7) приводятся данные, свидетельствующие о том, что концентрация коллагена в коже человека снижается в процессе старения.

Не обсуждая гигантский разброс значений содержания коллагена в коже после 50 лет, авторы приходят к мнению о том, что для поддержания кожи в нормальном состоянии необходимо ингибировать процесс ферментативной деградации коллагена. С этой целью предлагается использовать специфические ингибиторы коллагеназы, предназначенной для расщепления коллагеновых фибрилл. На особенностях этого процесса мы остановимся в дальнейшем. А сейчас попробуем сформулировать очередной парадокс, вытекающий из сопоставления данных, приведённых на рис.9.6 и 9.7. Назовём его парадоксом деградации и синтеза коллагена.

Рисунок 9.7 Зависимость содержания коллагена в пересчете на единицу площади кожи от возраста человека

Зависимость содержания коллагена в пересчете на единицу площади кожи от возраста человека

Мне могут возразить, так как на рис.9.6 представлено увеличение суммарного веса коллагена в сухожилии хвоста крысы, а на рис.9.7 - снижение содержания коллагена в коже человека. Однако не следует делать скоропалительных выводов. Во-первых, фермент коллагеназа всегда находится в зоне расположения "своего" субстрата. Не важно, в каком органе животного находятся коллагеновые фибриллы - в сухожилии хвоста или в коже. Предназначение коллагеназы в том и состоит, чтобы "расшивать" коллагеновые нити, способствуя процессу их обновления, так как коллагеназа совместно с протеолитическими ферментами деструктурирует коллагеновую молекулу до низкомолекулярных пептидов, которые вновь в качестве исходного материала возвращаются в фибробласты, в которых и происходит синтез новых предшественников коллагена. Как отмечают авторы работы [31], за счёт этого процесса коллаген постоянно обновляется с полупериодом жизни (τ1/2) около 15 суток. И теперь для разрешения ситуации, представленной в виде парадокса, следует предположить, что по каким-то причинам в процессе старения организма коллагеназа крысы замедляет расщепление коллагена, сдвигая динамическое равновесие в сторону увеличения его синтеза, а человеческая коллагеназа наоборот усиливает свою активность, сдвигая равновесие в сторону снижения концентрации коллагена. Можно было, конечно, объяснить последнее обстоятельство увеличением скорости синтеза коллагена в фибробластах кожи. Однако ряд косвенных данных позволяет считать такое объяснение маловероятным.

Так как причины различного реагирования систем синтеза и деструкции коллагена в хрящике крысиного хвоста и в коже человека не ясны, и, более того, кажутся маловероятными, следует обратить особое внимание на данные, представленные на рис.9.7.

Авторы работы [31] приводят также график, свидетельствующий о том, что в процессе старения организма снижается толщина дермы (см. рис.9.8)

Рисунок 9.8 Изменение толщины кожи человека в процессе старения
( - женщины, - мужчины)


Изменение толщины кожи человека в процессе старения

На наш взгляд, график в первую очередь демонстрирует, насколько сложны для интерпретации биологические (биохимические) эксперименты. Вне всякого сомнения, можно было провести соответствующие линии с гораздо большим или меньшим наклоном без существенного ухудшения качества корреляции.

Но, даже оставаясь на позиции авторов цитируемой работы, для ответа на вопрос о том, насколько изменится содержание коллагена в коже, целесообразно относить его не к единице площади кожи, а к единице объёма. Приняв (вместе в авторами) за основу приведённую на рис.9.8 линию, характеризующую снижение толщины дермы в процессе старения (для женщины и мужчины), мы провели перерасчёт графика, представленного на рис.9.7.

Полученные результаты, приведённые на рис.9.9, на наш взгляд, не позволяют говорить о каком-либо существенном снижении количества коллагена в коже человека в процессе старения. Более того, как мы уже отмечали выше, однозначность приведённой на рис.9.8 корреляции может вызывать сомнение. Поэтому, если увеличить угол наклона приведённой на этом рисунке линии, то на рис.9.11 можно получить зависимость, аналогичную той, которая характеризуется накоплением коллагена в сухожилии хвоста крыс (см. рис.9.6) Вот и весь парадокс!

Рисунок 9.9 Изменение концентрации коллагена на единицу объёма кожи человека в зависимости от возраста

Изменение концентрации коллагена на единицу объёма кожи человека в зависимости от возраста

Однако для окончательной ликвидации парадокса деградации и синтеза коллагена необходимо провести дополнительные тщательные исследования. Во всяком случае, необходимо в обязательном порядке разобраться в причинах аномального разброса точек на рис.9.7 и 9.9 (после 50 лет) и провести детальный регрессионный анализ данных, приведённых на рис.9.8. В настоящее время следует признать, что в вопросе о том, накапливается коллаген в коже в процессе старения организма или, наоборот, его концентрация снижается, ясности нет. А значит существует сформулированный нами парадокс.

Более того, расположение точек на рис.9.9 позволяет сформулировать "крамольное" предположение о том, что суммарное количество коллагена в пересчете на единицу объема кожи в течение всей жизни человека фактически не меняется. Следствия, которые вытекают из этого предположения, как будет показано в дальнейшем, могут поколебать некоторые "устойчивые" на данный момент косметологические постулаты.

Для объяснения изменений, происходящих с коллагеном в коже человека, можно привлекать многочисленные данные о влиянии ферментов и продуктов перекисного окисления липидов, способствующих образованию поперечных сшивок, и обсуждать возможное влияние на этот процесс изменений, протекающих на генетическом уровне (см., например, [31]). Однако, при этом можно "утонуть" в разнообразных взаимосвязанных фактах и проявлениях, не добравшись до сути изучаемого (весьма сложного) процесса. На наш взгляд, в таких случаях является целесообразным использование в определённой степени упрощённых логических построений, которые опираются на имеющиеся экспериментальные данные и справедливость которых может быть проверена опытным путём.

В данном случае предлагаем обсудить процесс синтеза и деструкции коллагена с учётом наличия динамического равновесия между скоростями этих реакций.

9.2.4. Равновесный процесс синтеза и деструкции коллагена

Для обсуждения этого вопроса нам потребуется вспомнить сведения о коллагене и о его локализации в коже.

Коллаген вместе с эластином и ретикулином является опорно-структурным белком, локализованным в дерме. Он составляет основную массу дермы (до 70% в пересчёте на сухой вес) и является главным структурным компонентом соединительной ткани. Этот специфический по аминокислотному составу и по строению белок не растворяется в воде в обычных условиях (только набухает). Протеолитические ферменты (пепсин, трипсин, папаин) расщепляют лишь растворимые фрагменты коллагеновых нитей. Ферментом, который способен перевести коллагеновую нить (фибриллу) в растворимое состояние за счёт частичного гидролиза, является коллагеназа.

В целом, в упрощённом виде процесс синтеза и деструкции представлен на рис.9.10.

Рисунок 9.10 Схема процесса синтеза и деструкции молекул коллагена

Схема процесса синтеза и деструкции молекул коллагена

Для такого рода процессов в норме характерно обязательное наличие равенства скоростей:

Vсинт=Vдестр.

Равенство скоростей синтеза и деструкции коллагена определяет наличие устойчивого динамического равновесия. Естественно предположить, что при увеличении скорости синтеза или снижении скорости деструкции коллагеновых фрагментов может наступать состояние организма, связанное с излишней коллагенизацией дермы и, наоборот, при снижении скорости синтеза и увеличении скорости деструкции может наступить деколлагенизация ткани дермы.

На наш взгляд, существует заблуждение, связанное с тем, что полагают, будто бы синтез коллагена осуществляется быстрее, чем его деградация. Так в монографии [32] в разделе "Обмен коллагеновых белков" сообщается следующее: "В нормальных условиях коллаген синтезируется со скоростью сравнимой с темпом образования других белков. Но разрушается коллаген очень медленно (период полураспада 50-60 дней, что является особенностью его обмена. Преобладание синтеза коллагена над его деструкцией обусловлено тем, что вновь образованные молекулы этого белка слишком ригидны и недоступны для действия протеологических ферментов". Возникает интересная ситуация. С одной стороны, многие полагают, что количество коллагена в коже в процессе старения организма снижается (см. п.9.2.3). А с другой стороны, снижение скорости деструкции коллагена при нормальной скорости синтеза должно приводить к его накоплению.

Пусть извинят меня уважаемые читатели, но мне придётся использовать примитивную аналогию из арсенала школьных задач о бассейне, в который через одну трубу вливается вода, а через другую - более узкую - выливается. Бассейн переполнится. Логика требует накопления коллагена в коже. Весь вопрос только в том, когда произойдёт переполнение этого "бассейна". Следует заметить, что автор цитируемого высказывания отчётливо формулирует это обстоятельство: "Преобладание синтеза над распадом определяет значительное накопление коллагена во внеклеточном пространстве в виде волокон". И вопрос заключается в том, какими темпами идёт накопление коллагена и какова, всё-таки, истинная причина его накопления.

Нам кажется, что автор вышеприведённых высказываний слишком драматизирует различия в скоростях синтеза и деструкции коллагена. Визуально и в 20, и в 30 лет и даже в более старшем возрасте изменения в состоянии кожи являются быстрыми, затрагивая только самые "слабые места" поверхности нашего тела (обычно первые морщинки появляются в уголках глаз, где самая тонкая кожа). Таким образом, процесс накопления визуальных изменений в состоянии кожи человека растянут на несколько десятков лет. А ведь если бы действительно коллаген разрушался "очень медленно", то мы были бы вправе ожидать появления этих изменений в гораздо более молодом возрасте (не приведи, Господи!).

Можно было бы, конечно, предположить, что по каким-то причинам скорость деградации коллагена, достаточно высокая в раннем периоде развития организма, замедляется в последующие годы, например, за счёт снижения активности фермента коллагеназы. К сожалению, у нас нет информации об изменении активности коллагеназы в процессе старения организма.

Таким образом, наиболее приемлемым вариантом описания состояния системы, связанной с синтезом и деструкцией коллагеновых нитей при нормальном состоянии организма, является обязательное равенство скоростей Vсинт. и Vдестр.. При этом величины абсолютных значений должны определять время жизни коллагеновой нити (τ). Чем выше равновесные скорости синтеза и деструкции, тем ниже значение τ и наоборот.

Как уже отмечалось ранее (см. п.9.2.2), в процессе старения организма в коже снижается содержание растворимого коллагена с одновременным повышением концентрации его нерастворимых форм, что свидетельствовало об увеличении числа межмолекулярных сшивок и возможном изменении структуры коллагена. Все это не могло не отразиться на процессе взаимодействия коллагеназы с коллагеновыми нитями, так как ферменты зачастую обладают значительной специфичностью. Поэтому при накоплении сшивок в молекуле коллагена коллагеназа в определенный момент могла потерять свою активность по отношению к видоизмененному под влиянием сшивок коллагеновому субстрату. То есть, фактически фермент мог потерять способность "узнавать" молекулу коллагена и реагировать с ним. Действительно, обнаружилось, что сшитый (нерастворимый) коллаген является устойчивым по отношению к коллагеназе [33], а измеряя количество коллагена, не реагирующего с эндогенной коллагеназой организма, можно определять возраст человека.

Таким образом, процесс старения организма сопровождается накоплением нерастворимых форм коллагена, которые не реагируют с коллагеназой. Это может означать только одно - некоторое количество коллагенового субстрата выводится из рассмотренного выше равновесного процесса синтеза и деструкции коллагеновых нитей, и время жизни (τ) этих молекул увеличивается до бесконечности. В результате количество сшивок в молекулах нереакционноспособного по отношению к коллагеназе коллагена продолжает увеличиваться, и коллагеновый матрикс кожи становится все более жестким, что приводит к снижению эластичности кожи и появлению (фиксации) морщин. Жесткий коллаген накапливается в коже, неотвратимо способствуя проявлениям ее старения. Оставшиеся без изменения коллагеновые фрагменты или фрагменты, количество сшивок в которых оказалось недостаточным для того, чтобы заблокировать деструкцию коллагена, продолжают участвовать в циклическом равновесном процессе, приводя к синтезу новых немодифицированных (если хотите - "молодых") коллагеновых структур. Вообще, такого рода циклические равновесные процессы есть ни что иное, как естественная система защиты структуры биополимеров от возможных изменений, способствующая увеличению стабильности биологических структур и организмов. К этим процессам с участием других биополимеров мы еще вернемся. А сейчас попробуем сформулировать важные с точки зрения косметологов последствия участия коллагеновых структур в обсуждаемом равновесном процессе.

Примем за основу высказанное ранее предположение (см. п.9.2.3) о том, что суммарная объемная концентрация коллагена (растворимого и нерастворимого или коллагена, не взаимодействующего с эндогенной коллагеназой) в течение всей жизни человека остается величиной постоянной, о чем свидетельствует рис.9.11. Такое предположение нам представляется в достаточной степени обоснованным, так как, если существует механизм регулировки скорости синтеза пептидных предшественников коллагеновых нитей в фибробластах дермы, то основой такой регулировки, на наш взгляд, должна быть именно объемная концентрация коллагенового матрикса кожи.

Тот факт, что в процессе старения организма часть коллагеновых структур выводится из рассматриваемого динамического равновесия (синтез-деструкция), может служить косвенным доводом в пользу существования механизма регулировки синтеза коллагеновых предшественников фибробластами кожи. В противном случае мы должны были неизбежно столкнуться с явлением избыточной коллагенизации структур кожи. Такой механизм регулировки напоминает обсуждаемый нами ранее (см. гл.1) процесс контактного торможения деления клеток, в соответствии с которым при формировании монослоя в процесс деления вовлекаются только клетки, не имеющие соседей, а при полном формировании монослоя деление большинства видов клеток полностью прекращается!

Высказанное предположение слишком серьезно, чтобы не сформулировать очередной парадокс, который можно обозначить парадоксом регулировки синтеза коллагена.

Интересным представляется также то обстоятельство, что скорость деструкции коллагена при наличии механизма регулировки синтеза, в свою очередь, может регулироваться автоматически. Действительно, если в зоне действия эндогенной коллагеназы накапливаются сшитые коллагеновые структуры, а количество "молодых" или не очень модифицированных коллагеновых нитей, с которыми фермент может взаимодействовать, постепенно снижается, то снижается и общая скорость деструкции, зависящая от концентрации реакционноспособного субстрата. Наряду с этим увеличивается время жизни коллагеновых структур, вовлекаемых в процесс динамического равновесия, что, в свою очередь, увеличивает вероятность накопления сшивок и ускоряет процесс старения.

Имеются сведения о том, что обмен коллагена с возрастом постепенно замедляется, так как развитие сопровождается уменьшением скорости синтеза и разрушения коллагена. Отмечается также, что коллагеназа, когда в ней нет необходимости, существует в неактивной форме (М.Канунго, 1982). Эти факты, по нашему мнению, соответствуют высказанному ранее предположению, сформулированному в виде парадокса.

А теперь обратимся к возможным следствиям высказанного выше предположения. Если суммарное количество коллагена в единице объема кожи в течение всей жизни человека постоянно, то можно поставить под сомнение необходимость использования и полезность косметических препаратов, содержащих в своем составе ингредиенты коллагеновой природы.

Допустим, мы используем кремовую композицию, содержащую коллаген, извлекаемый из соединительной ткани или хрящей молодых животных. Естественно полагать, что молекулы такого коллагена практически не имеют внутри- и межмолекулярных сшивок и поэтому достаточно эластичны. Очевидным результатом нанесения такого крема на поверхность кожи окажется сиюминутное повышение ее эластичности. Однако, учитывая наличие предела проницаемости кожи (см. гл.4), можно полагать, что эффект применения такой композиции в большинстве случаев исчезнет сразу после процедуры удаления крема с поверхности кожи. В достаточной степени высокомолекулярные коллагеновые структуры не могут проникнуть в глубь кожи, оставаясь на ее поверхности. Совершенно иная ситуация возникает при использовании коллагеновых структур с молекулярными массами ниже 100 кDa. Обладая способностью преодолевать трансэпидермальный барьер, эти структуры, с одной стороны, более эффективно повышают эластичность кожи, влияя не только на ее поверхность, но и затрагивая более глубокие слои. Однако, с другой стороны, попадая в зону действия коллагеназы, коллагеновые фрагменты способны отвлекать фермент от взаимодействия с собственным коллагеновым матриксом кожи и, в результате, скорость основной реакции снижается - наступает известное в биохимии состояние, называемое конкурентным торможением основного процесса. Такое торможение увеличивает время жизни собственных коллагеновых структур и, соответственно, вероятность образования внутри- и межмолекулярных сшивок. Все это неотвратимо ведет к ускорению старения кожи. Таким образом, если наши предположения верны, то с позиций теории мягких косметологических воздействий использование кремовых композиций, содержащих коллагеновые фрагменты, способные преодолевать трансэпидермальный барьер, при кажущейся сиюминутной полезности может иметь отрицательные последствия, ускоряя процессы старения коллагеновых структур кожи.

Ранее (см. п.7.2.1) мы намеревались сформулировать парадокс, суть которого сводится к тому, что можно подвергнуть сомнению целесообразность использования в косметологии любых сырьевых источников коллагенового происхождения, способных отвлекать фермент коллагеназу от основной реакции. Предлагаем назвать это обстоятельство парадоксом отвлекающих связей и будем надеяться, что специальные эксперименты подтвердят или, наоборот, позволять отбросить сделанные нами предположения, которые (следует подчеркнуть) появились не на пустом месте.

Ну, а пока нам придется отложить в сторону рекламный лист ООО НПФ "ЛитА-Цвет", в котором красивыми словами описывается "уникальный биологический стимулятор тканей..., который по своему аминокислотному составу близок к фармакопейному коллагену, однако во многом превосходит его уже тем, что содержит биокомпоненты как высокой, так и низкой молекулярной массы..." Авторам этой разработки, в свете всего вышеизложенного, можно посоветовать убрать из состава гидролизата "среднюю фракцию" с молекулярными массами компонентов от 500 до 100000 Da.

И еще одно следствие, вытекающее из предыдущих рассуждений, нужно иметь в виду. Оно связано с необходимостью тщательной проверки исходного сырья для производства косметических препаратов на совместимость с ферментами кожи и, в частности, с коллагеназой.

9.2.5. Биохимическая тест-система для оценки качества сырья для производства косметических препаратов

Как уже указывалось ранее (см. гл.2), теория мягких косметологических воздействий определяет подходы, позволяющие влиять на биохимические процессы и взаимопревращения клеточных систем кожи с целью замедления ее старения. В этой связи выводы, которые были сделаны выше, точно соответствуют положениям сформулированной нами теории. Поэтому вполне естественным выглядит предложение о необходимости контроля исходного сырья для производства косметических препаратов на совместимость с ключевыми ферментами кожи.

Все началось с образцов глицерина, которые находились в наших руках: два образца разного качества производства Новосибирского масложиркомбината, глицерин квалификации "хr", образец химически синтезированного глицерина, полученного на предприятии Алтайхимпром (г.Славгород), и образец фирмы "Сигма". Оказалось, что все образцы без исключения полностью инактивировали коллагеназу, содержащуюся в физиологическом растворе. В результате длительных экспериментов по очистке глицерина и его облучению ускоренными электронами с применением ИK-спектрометра с фурье-преобразованием, позволяющего суммировать (накапливать) и вычитать спектральные характеристики образцов, было показано, что неочищенные образцы глицерина в микроколичествах содержат примесь, характеризующуюся поглощением в области 1650 см-1. Естественным было предположить, что в глицерине присутствует акролеин, образующийся из глицерина в процессе протекания следующей реакции:

молекула которого имеет характеристическое поглощение в указанной области ИK-спектра. Следует заметить, что в соответствии с техническими условиями глицерин не должен содержать акролеин в заметных количествах. Однако и микроколичеств акролеина оказалось достаточно, чтобы инактивировать фермент - коллагеназу. Так как акролеин способен образовываться из глицерина при комнатной температуре в присутствии кислорода воздуха, возникла технологическая проблема, решение которой оказалось очень простым. Исходя из предположения, что наиболее реакционноспособной в акролеине является альдегидная группа, способная взаимодействовать с аминогруппами белков, пептидов и аминокислот, мы предложили [34] способ обработки глицерина, включающий приготовление смеси глицерина с биологически активными реагентами пептидно-белковой природы с их общей концентрацией в глицерине от 0,05 до 1 мг/мл с последующим выдерживанием смеси в течение времени, достаточном для полной нейтрализации реакционноспособных примесей в глицерине. Проще говоря, мы вначале инактивируем акролеин с помощью вещества белково-пептидной природы, а затем уже показываем, что активность фермента в присутствии модифицированного глицерина (глицерин марки "Экстра") полностью сохраняется.

На наш взгляд, применение модифицированного глицерина является оправданным в тех случаях, когда его содержание в косметических препаратах составляет заметную величину, например, при производстве "душистых" глицеринов, средств для смягчения рук и т.п.

В описанной выше ситуации с глицерином вначале была выявлена причина инактивации фермента. А как быть с многокомпонентными сырьевыми системами?

Нас заинтересовали отдушки и эфирные масла. Следует заметить, что в большинстве рассмотренных нами составов (см.Приложение 1) типы, составы отдушек и даже их обозначения просто не приводятся. Это очень симптоматично, так как разработчики косметических препаратов просто считают, что влияние этих систем на кожу не является существенным. Главной задачей такого рода ингредиентов, естественно, является маскировка запахов основного технологического сырья и, возможно, придание привлекательности косметическому препарату посредством запаха. Не зря у потребителя косметических средств первым делом возникает желание понюхать содержимое флакона.

Таким образом, компоненты отдушек, используемых в качестве ингредиентов косметических средств, испаряясь с поверхности нанесенного на кожу косметического средства, создают над поверхностью тела разнообразные ароматы. Однако, являясь ингредиентами косметических средств и обладая обычно малыми молекулярными массами, они легко преодолевают трансэпидермальный барьер, попадая в зону действия клеточных и ферментативных систем кожи.

К моменту начала работы у нас в руках было двадцать образцов отдушек, любезно предоставленных нам фирмами "Роберте" (Франция) и "Драгоко" (Австрия). Перечень образцов отдушек приведен в табл.9.14.

Испытания проводились при концентрации фермента не менее 0,05 мг/мл, времени выдержки опытного образца с ферментом при комнатной температуре в течение 24 часов и концентрации отдушки равной 1%. В качестве положительного контроля использовали раствор фермента в физиологическом растворе при рН7.2. В качестве отрицательного контроля использовали 1% раствор формалина, смешанный с раствором фермента.

Таблица 9.14 Перечень образцов, проверенных на совместимость с коллагеназой

Перечень образцов, проверенных на совместимость с коллагеназой

При пятнадцатиминутном экспонировании полученных после суточного выдерживания растворов образцов только пять отдушек (2 образца фирмы "Robertet" и 3 образца фирмы "Dragoco") показали результат, близкий к положительному контролю, то есть оказались совместимыми с коллагеназой. Соответственно, пять образцов из двадцати испытанных подобно формалину в указанных условиях подавили активность фермента (три образца фирмы "Robertet" и два образца фирмы "Dragoco").

Для остальных десяти образцов получены промежуточные результаты, свидетельствующие о частичном подавлении активности фермента.

Мы специально не указываем конкретные образцы отдушек, проявивших совместимость и несовместимость с коллагеназой, так как использованная методика имеет некоторые особенности, которые требуют детализации и уточнения*). Сегодня мы готовим "плацдарм" для дальнейшего продвижения в данном направлении. Но факт остается фактом - отдушки, используемые в качестве ингредиентов косметических средств, не являются нейтральными для кожи веществами, и в соответствии с положениями теории мягких косметологических воздействий возникает необходимость их тестирования как с применением описанного выше биохимического подхода, так и на клеточных тест-системах. Перед исследователями открывается совершенно нетронутое поле деятельности. Однако, следует отчетливо понимать, что пройдет еще немало времени, прежде чем разработчики косметических препаратов начнут указывать в составах типы используемых отдушек и, тем более, избегать применения препаратов, не совместимых с ферментами кожи.


*) Информация может быть передана фирмам - производителям отдушек и разработчикам косметических средств на определенных условиях с обязательным соблюдением конфиденциальности.

9.2.6. Фермент коллагеназа в качестве ингредиента косметических препаратов

Имеется еще одно интересное для косметологов следствие функционирования рассмотренного динамического равновесного процесса синтеза и деструкции коллагеновых волокон. Оно сводится к тому, что если собственная (эндогенная) коллагеназа, расположенная в зоне коллагенового матрикса кожи с возрастом начинает "пропускать" некоторые модифицированные сшивками коллагеновые структуры, которые, накапливаясь в коже снижают ее эластичность, то возникает желание помочь организму за счет введения дополнительных количеств фермента. При этом необходимо, чтобы были выполнены следующие основные условия:

- молекулярная масса фермента должна обеспечивать реальный доступ к внутренним структурам кожи;

- вводимая коллагеназа должна обладать меньшей специфичностью действия по сравнению с эндогенной коллагеназой кожи человека или взаимодействовать с более широким набором субстратов;

- взаимодействие с клеточными системами должно быть в достаточной степени щадящим.

Существует большое количество ферментов, обладающих коллагенолитическим действием.

Внимание косметологов привлекает коллагеназа, выделенная из печени дальневосточных крабов, технология производства которой освоена в Тихоокеанском институте биоорганической химии.

По данным работы [35], очищенный препарат коллагеназы содержит набор веществ с молекулярными массами от 16 до 32 кDa. Доминирующей (до 80%) является молекулярная масса 23,5 кDa.

Этот препарат обладает способностью разрушать пептидные связи в природном коллагене. В зависимости от степени очистки коллагенолитическая активность препарата может сопровождаться трипсиноподобной, химотрипсиноподобной, карбогидразной и ДНКазной активностями.

Имеющиеся данные позволяют полагать, что коллагеназа, выделенная из печени дальневосточных крабов, отличается специфичностью действия, например, от препаратов коллагеназ, выделяемых микроорганизмами рода Clostridium.

Коллагенолитический фермент из печени краба проявляет высокую активность по отношению к различным типам природного коллагена. Так он, в отличие от микробных коллагеназ, расщепляет коллаген III типа из кожи теленка и коллаген IV типа из хрусталика глаза быка. Являясь ферментом, относящимся к классу сериновых протеаз, коллагеназа гидролизует специфические субстраты для трипсина, химотрипсина и эластазы.

Показано также [35], что очищенная коллагеназа, выделяемая из печени крабов, в определенных концентрациях совместима с многими клеточными системами. Так, обработка монослоя таких перевиваемых клультур клеток, как L68, SV1, MDCK, Hep2 и ЛЭЧ приводит к достаточно быстрому отслоению клеток от твердого субстрата с сохранением их морфологии и низким процентом мертвых клеток при концентрации фермента от 0,0001 до 0,01%.

Таким образом, рассмотренные выше характеристики коллагенолитического препарата позволяли полагать наличие потенциальной возможности его эффективного использования в качестве добавки к косметическим композициям, предотвращающим или тормозящим механизм старения кожи, связанный с накоплением сшивок в молекулах коллагена. Действительно, молекулярная масса фермента позволяет ему с определенной степенью вероятности достигать зоны локализации коллагеновых нитей (сосочковый слой дермы). Те немногочисленные сведения об особенностях специфичности действия ферментативного препарата позволяли надеяться на реализацию своеобразной "помощи" эндогенной коллагеназе человека. Так, например, для косметологов чрезвычайно важным является вовлечение в реакцию гидролиза тех коллагеновых нитей, с которыми уже не может взаимодействовать собственная коллагеназа. Если бы такой процесс в действительности был запущен с помощью добавляемой экзогенной коллагеназы, то это, образно говоря, напоминало бы эффект дополнительного дворника, вычищающего "мусор" из тех углов, куда не дотягивается метла основного уборщика. Однако, мы должны признать, что для окончательных утверждений о реализации такого рода процесса у нас нет достаточных оснований. Как обычно в таких случаях, при отсутствии информации можно сформулировать парадокс эффекта дополнительного дворника.

Тем не менее, введение в косметические средства коллагеназы, выделенной из печени крабов, кажется оправданным с той точки зрения, что воздействуя на коллагеновые нити совместно с эндогенной коллагеназой и ускоряя тем самым скорость их деградации, препарат будет способствовать снижению времени жизни коллагеновых нитей и, соответственно, снижению вероятности накопления сшивок. А щадящее действие препарата на клеточные культуры с позиций теории мягких косметологических воздействий разрешает движение разработчиков косметических средств в указанном направлении.

По информации Тихоокеанского института биоорганической химии, в НПО "Косметология" (г.Москва) было проведено экспериментальное изучение безвредности, биохимических механизмов действия, а также влияния на структуру кожи комплекса ферментов "коллагеназа крабов". На основании этих исследований рекомендовано использовать этот препарат в концентрации 0,75% в косметических препаратах, предназначенных для ухода за увядающей кожей лица. К сожалению, мы не имеем информации об активности и качестве используемой в этих экспериментах коллагеназы. Однако несколько смущает то обстоятельство, что рекомендуемая концентрация превышает щадящую для клеток концентрацию в 75-7500 раз [35]. Причины такого превышения могут быть связаны с различиями в активностях (чистоте) испытуемых препаратов. Однако нам это представляется маловероятным. Скорее всего, мы снова имеем дело с косметологическими парадоксами, связанными с безоглядным использованием аномально высоких концентраций биологически активных веществ. И в этом случае разработчикам косметических средств нет никакого дела до того, что будет происходить с клетками базального слоя эпидермиса при воздействии ферментов в "рекомендуемых" концентрациях. Если же подобный вопрос задать цитологу, клеточному биотехнологу ("культуральщику"), то в ответ можно получить любопытные высказывания. Складывается такое впечатление, что косметологи скорее уподобляются "кожевенных дел мастерам", так как сопоставимые концентрации препарата "Коллагеназа краба" используются при выделке шкур животных (информация Тихоокеанского института биоорганической химии) для получения одежных кож, кож для верха обуви из сырья крупного рогатого скота и особо эластичных кож из свиного сырья. Технология выделки кож с использованием коллагеназы масштабирована на Московском кожевенно-обувном комбинате и кожевенном заводе им.Тельмана (АО "Роскон", г.Москва), и получаемая продукция по физико-химическим характеристикам вполне соответствует нормам. Любопытнейшая аналогия!

Возвращаясь к основной задаче косметологии, предусматривающей противодействие процессу старения кожи (см. гл.1), и к теории мягких косметологических воздействий, позволяющей влиять на биохимические процессы и взаимопревращения клеточных систем кожи, для реализации этой основной задачи (см. гл.1) необходимо подчеркнуть, что даже те концентрации фермента, которые использовались авторами работы [35] для достижения своих целей (отделение монослоя от субстрата, диспергирование животных тканей), по-видимому, не могут служить ориентиром для конструирования "щадящих" косметических средств. Наиболее приемлемые концентрации коллагеназы в косметических средствах, на наш взгляд, не должны значительно превышать содержание коллагеназы в структуре кожи человека. По крайне мере, клеточные тест-системы должны выдерживать действие фермента больший период времени, чем 5-15 минутное воздействие, используемое авторами работы [35]. Этот вопрос требует детального рассмотрения и, возможно, экспериментальной проверки. И нас не должно "убаюкивать" то обстоятельство, что при концентрации 0,75% препарат "Коллагеназа краба", добавляемый в косметическое средство, благотворно влияет "на морфологическую структуру кожи". Детальное обоснование концентрации потребовало бы от экспериментаторов постановку специальных экспериментов для выявления отдаленных последствий.

Следует однако заметить, что при обсуждении этого вопроса мы сознательно выпустили из рассмотрения проблему стабильности коллагеназы и ее совместимость с технологией производства косметических средств. По данным Тихоокеанского института биоорганической химии, фермент должен храниться при температуре - 20-0°C. Срок хранения при этом составляет 3 года. К сожалению, мы не имеем информации об условиях приготовления опытных образцов кремовых композиций, используемых НПО "Косметология" в эксперименте, также как и о том, проверялась ли конечная активность фермента в опытных образцах в процессе его проведения, и в каких условиях хранились эти образцы. Однако на основании собственных исследований [36] мы можем утверждать, что коллагенолитическая активность фермента сохраняется при выдерживании косметического препарата, содержащего 0,05% специально очищенной коллагеназы, выделенной из печени дальневосточных крабов, облепиховое или пихтовое масло, экстракт прополиса и гель полиэтиленоксида (в качестве основы) при +7°C в течение шести месяцев. Наряду с этим, при +37°C активность препарата снижается практически до нулевых значений в течение нескольких суток. Таким образом, это тот самый случай, когда хранение косметического средства требует пониженных температур.

9.3. Пути старения кожи, связанные с модификацией других биополимеров

В структуре и функциях кожи существенную роль играют мукополисахариды (гликозаминогликаны), к которым следует отнести гиалуроновую кислоту. Она обнаруживается в зернистом и более низких слоях эпидермиса, а также в сосочковом слое дермы. Молекулярная масса гиалуроновой кислоты может превышать 100 млн.Dа. Повторяющимся фрагментом этого биополимера является соединение глюкуроновой кислоты и аминосахара, у которого один из атомов водорода аминогруппы замещен на ацильный фрагмент (остаток уксусной кислоты). Замечательным физическим свойством гиалуроновой кислоты является ее способность образовывать стабильный гель с молекулами воды, обладающий высокой вязкостью. Это обстоятельство определяет функции гиалуроновой кислоты, связанные с поддержанием влажности эпидермиса и внутренних структур кожи, а также ее роль в качестве цементирующего вещества, связывающего клетки, коллагеновые пучки и фибриллы между собой.

Как и любой биополимер, гиалуроновая кислота находится в определенных взаимоотношениях с соответствующим ферментом - гиалуронидазой. Совершенно очевидно, что эта пара субстрат (гиалуроновая кислота) - фермент (гиалуронидаза), по аналогии с коллагеном и коллагеназой, участвует в динамическом равновесном процессе, основная роль которого заключается в предотвращении накопления внутри и межмолекулярных сшивок в молекуле гиалуроновой кислоты. Скорости реакции синтеза и деструкции гиалуроновой кислоты, по-видимому, зависящие от возраста организма и других параметров, характеризуются периодами полураспада от 1,9 до 7,7 суток, что примерно соответствует времени жизни молекулы гиалуроновой кислоты от 4 до 16 суток.

Гиалуронидаза кожи преимущественно взаимодействует с гиалуроновой кислотой, имеющей высокую молекулярную массу, а последующая деградация фрагментов гиалуроновой кислоты завершается другими ферментами. Деполимеризация гиалуроновой кислоты ведет к увеличению проницаемости кожи и, наоборот, высокая степень полимеризации, достигаемая, в том числе, и за счет возможных дополнительных сшивок, например, под влиянием продуктов ПОЛ, приводит к снижению проницаемости кожи. Это обстоятельство представляется очень важным, хотя бы потому, что все метаболиты плазмы крови на пути к базальным клеткам вынуждены преодолевать гелевую систему гиалуроновой кислоты и скорость их поступления к клеткам будет зависеть от состояния ее молекулы. Аналогичным образом продукты клеточного метаболизма удаляются в лимфатическую и венозную системы.

Таким образом, регулировка вязкости геля, образуемого полисахаридами с водой, является весьма существенным процессом.

Как уже отмечалось ранее (см. п.4.6), наличие барьера проницаемости кожи делает бессмысленными попытки введения гиалуроновой кислоты с высокими молекулярными массами в косметические препараты с целью влияния на рассматриваемое динамическое равновесие, поддерживающее вязкость геля на определенном уровне. Единственно достижимым результатом введения индивидуальной гиалуроновой кислоты в косметические средства является увлажнение поверхности кожи. При этом, естественно, нельзя исключать воздействия на внутренние структуры кожи биологически активных низкомолекулярных фрагментов, которые могут быть связаны (включены в гель) с гиалуроновой кислотой. Что же касается низкомолекулярных фрагментов гиалуроновой кислоты, способных преодолевать трансэпидермальный барьер, то, по аналогии с системой коллаген-коллагеназа, можно предположить их негативное влияние за счет отвлечения гиалуронидазы от основной реакции (конкурентное торможение). Во всяком случае, при введении низкомолекулярных субстратов гиалуроновой кислоты, мы можем ожидать увеличения вязкости геля, образованного гиалуроновой кислотой, снижения скорости доставки питательных веществ к базальному слою клеток эпидермиса и повышения концентрации продуктов клеточного метаболизма в зоне расположения этих клеток. В соответствии с основными постулатами теории мягких косметологических воздействий реализация такого рода событий будет нарушать динамическое равновесие формирования эпидермиса, ускоряя процессы, ведущие к старению кожи.

Естественным образом, по аналогии с коллагеназой, можно рассматривать варианты создания косметических композиций, содержащих гиалуронидазу (см., например, [37]). При этом возникают фактически те же самые вопросы, на которые мы пытались ответить в предыдущем обсуждении коллагенового пути старения кожи:

- величина молекулярной массы молекулы гиалуронидазы;

- величина оптимальной концентрации фермента;

- стабильность фермента в процессе приготовления косметического препарата и его хранения.

Все эти вопросы также требуют детального обсуждения.

Собственно говоря, коллагеназа и гиалуронидаза являются важнейшими ферментами, требующими особого внимания косметологов. Это вытекает хотя бы из того, что оба фермента и их субстратные пары (коллаген и гиалуроновая кислота) локализованы в межклеточном пространстве кожи, и влияние компонентов косметических средств на динамические равновесные процессы синтеза и деструкции биополимеров может носить характер прямого взаимодействия. Несколько иначе обстоит дело, например, с такими парами как нуклеиновые кислоты и нуклеазы. Основные события, связанные с синтезом и деструкцией нуклеаз разворачиваются во внутриклеточном пространстве, отделенном от межклеточного бислойной липидной мембраной. Поэтому, только в случае проникновения ингредиентов косметического средства во внутриклеточное пространство возможно их прямое влияние на динамическое равновесие между брутто-скоростями синтеза и деструкции нуклеиновых кислот, существование которого из общих соображений, несмотря на всю сложность рассматриваемых процессов, не должно вызывать сомнений. В противном случае реализовались бы варианты, связанные либо с накоплением, либо с дефицитом субстрата.

На этом этапе мы можем ограничиться приведенными выше весьма общими соображениями в надежде на более полновесное и плодотворное обсуждение функционирования ферментативных систем кожи в дальнейшем с целью реализации основной задачи косметологии - поддержание хорошего состояния кожи максимально длительный период времени. Предлагаем вначале все-таки разобраться с допустимыми концентрациями ферментов. И, конечно, основным критерием качества косметических средств должна быть оценка влияния их ингредиентов на процесс формирования эпидермиса (в зависимости от возраста потребителя), являющийся ключевым вопросом теории мягких косметологических воздействий (см. гл.2).

9.4. Косметические композиции с одновременной блокировкой нескольких механизмов старения кожи

Завершая рассмотрение механизмов старения кожи, которые обсуждались прямо или косвенно в различных разделах этой монографии, следует подвести некоторые итоги.

В процессе старения организма человека отчетливо могут прослеживаться варианты неблагоприятных изменений, которые отражаются на состоянии кожи.

А. Процессы перекисного окисления липидов, продукты которого могут провоцировать существенные изменения в функционировании клеточных и биохимических систем кожи.

Б. Ухудшение реологических характеристик движения межклеточной жидкости, поставляющей питательные вещества базальным клеткам эпидермиса и удаляющей продукты клеточного метаболизма из зоны расположения этих клеток.

В свою очередь причинами такого ухудшения могут являться:

Б.1. Сужение и потеря эластичности микрокапилляров (петелек) кровеносной системы, расположенных в сосочковом слое дермы.

Б.2. Снижение проницаемости геля гиалуроновой кислоты (и других полисахаридов), через который и осуществляется доставка питательных веществ и удаление продуктов клеточного метаболизма.

В. Увеличение жесткости коллагеновых структур кожи.

Г. Изменение уровня и соотношения гормонов и гормоноподобных веществ в плазме крови человека.

А теперь на основании всего вышеизложенного можно представить себе идеальную кремовую композицию, допустим, для возраста 30-35 лет и старше. Очевидно, в ее составе должны содержаться вещества, обладающие антиоксидантным действием (блокировка механизма старения, связанного с реализацией ПОЛ - вариант А), вещества, способствующие повышению эластичности микрокапилляров сосочкового слоя дермы, или иные приемы, повышающие их эластичность (блокировка механизма старения по варианту Б.1), фермент гиалуронидаза (блокировка механизма старения по варианту Б.2), фермент коллагеназа (блокировка механизма старения по варианту В и регенерирующие добавки, обладающие гормональной и регулирующей деление клеток активностью (блокировка механизма старения по пути Г). Для блокировки варианта Б.1 возможно также использование строго выверенных в зависимости от возраста концентраций питательных ингредиентов.

Первые попытки решения такого рода комплексных задач уже предпринимаются (см., например, [37]).

ЛИТЕРАТУРА:

1. Дамберг Б.Э., Изв. АН Латв. ССР, 1976(1)97-105;

2. Айрапетяну М.Г., Левшина И.П., Гулеева Н.В., Журн.высш.нервн.деят., 1986, 36(3)554-560;

3. Коваленко В.М., Вилков Г.А. и др., Бюл.экспер.биол., 1987, 104(10)440-441;

4. Козлов Г.С., Носков С.М., Вопр.мед.химии, 1986, 32(5)1-44;

5. Панисюк Е.Н., Скакун Л.Н., Косм.биол., 1985, 19(1)48-52;

6. Худжамбердиев М., Бюл.экспер.биол., 1985, 100(9)285-286;

7. Шилина М.К. "Структура, биосинтез, превращения липидов в организме животного и человека" М.; 1975;

8. Мохов В.М., Блюдзин Ю.А., Вопр.мед.химии, 1987, 33, 38-42;

9. Корф И.И., Мещерякова В.А. и др., Вопр.мед.химии, 1987, 33(3), 73-77;

10. Ушкалова В.Н., Иоанидис Н.В. и др. "Современные проблемы биоорганической химии и химии природных соединений", Алма-Ата, 1984, с.499-509;

11. Anderton P., Wild T.F., Biochem. Biophys. Res. Commun., 1981, 103, 285-291;

12. George A.M., Lunes J., Cramp W.A., J.Radit. Biol., 1983, 43(4)363-378;

13. Klenk H.D., Choppin P.W., Virology, 1970, 40, 939-947;

14. Lynch R.D., Locicero J., Scheneeberger E.E., Lipids, 1986, 21,447-453;

15. McSharry J.J., Wagner R.R., J.Verol., 1971, 7(1)59-70;

16. Moore N.F., Moore J.C., Kelly D.C., Microbiologica, 1984, 7,267-272;

17. Stoll L.L., Spector A.A., In vitro, 1984, 20(9)732-738;

18. Адамс Р. "Методы культуры клеток для биохимиков" М.; Мир, 1983;

19. "Методы биохимических исследований", под ред. М.И.Прохоровой, Л.; ЛГУ, 1982;

20. Jurin R.R., McCuno S.A., J.Cell.Phusiol., 1985, 123(23)442-448;

21. Steckel F., Gieseler R. et al. "Heat shock protein expression and UV-light induced damage in cultured human skin cells" XX Congr. Intern. Federation of the Societies of cosmetic Chemists", Cannes, Sept. 14-18, 1998, V.1, 133-140;

22. Regnier M., Duval C. Schmidt R. "Potential cosmetic applications for reconstructed human epidermis", XX Congr.Intern Federation of the Societies of cosmetic Chemists", Cannes, Sept. 14-18, 1998, V.3, 49-50;

23. Golberg A.M., Frazier J.M. "Alternatives to animals in toxicity testing" Sci.Am., 1989,16-22;

24. Афиногенов Г.Е., Афиногенова А.Г. и др. "Новый способ выявления токсичности парфюмерно-косметических средств на культурах фибробластов кожи и легких эмбрионов человека" II Международная научно-практическая конференция "Биологически активные вещества и новые продукты в косметике" М., 1997, 68;

25. Zulli F., Liechti Ch. et al. "Application of nanoemulsions in in vitro toxicity and mutation assays" XX Congr. Intern. Federation of the Societies of cosmetic Chemists", Cannes, Sept. 14-18, 1998, V.2, 153-158;

26. Verzar F., Sci.Am., 1963, 208, 104-114;

27. Delbrilge L., Everitt A.V., Gerontology, 1972, 18, 169-175;

28. Davidson P.F., J.Biol.Chem., 1978, 253, 5635-5641;

29. Moriguchi T., Fujumoto D., J. Biochem., 1978, 24, 337-342;

30. Torres A.R., Gerontology, 1978, 24, 337-342;

31. Abdul Malak N., Perrier E. "TIMP-1 like; a new strategy for anti-aging cosmetic formulations" XX Congr. Intern. Federation of the Societies of cosmetic Chemists", Cannes, Sept. 14-18, 1998, V.1, 79-90;

32. "Кожа. Строение, функция, общая патология и терапия", под ред. А.М.Чернуха, Е.П.Фролова, М.; Медицина, 1982;

33. Hamlin C.R., Kohn R.R., Expl.Gerontol., 7, 377-379(1972);

34. Децина А.Н., Попова С.Р. и др. "Способ обработки глицерина" Пат.РФ №2133730, 22.07.96;

35. Сандахчиев Л.С., Зиновьев В.В., Царева А.А. и др. "Применение коллазы для культивирования клеток", Вопр. Вирусол., 39(6)284-286 (1994);

36. Зиновьев В.В., Попова С.Р. и др. "Средство для ухода за кожей" Пат.РФ №2089177, 1997;

37. Децина А.Н. "Косметический суперкрем для ухода за кожей" Пат.РФ №2139039, 1999.


Канунго М. "Биохимия старения" М.; "Мир", 1982;

Сахаров И.Ю, Литвин Ф.Е., Артюков А.А. "Физико-химические свойства коллагенолитической протеазы С камчатского краба", Биохимия, 1992, 57(1)340-45;

Руденская Г.Н., Исаев В.А. и др. "Выделение и свойства сериновой протеиназы РС камчатского краба paralithodes camtxchatica протеолитического фермента широкой специфичности", Биохимия, 1996, 61(6)1119-1132.

Задания к главе 9:

1. Изменения в строении каких биополимерных молекул живых организмов могут определять:

- мутагенное действие;

- аллергические реакции;

- снижение проницаемости кожи.

2. Назовите вещества, в антиоксидантной защите организма от перекисного окисления липидов.

3. Как меняются величины молекулярных масс молекул коллагена в коже в процессе старения организма?

4. Назовите ферменты, взаимодействующие с коллагеном, нуклеиновыми кислотами и гиалуроновой кислотой.



© Децина А.Н., 2001

Набор слушателей в Заочную школу научной косметологии
Объявление для слушателей Заочной школы научной косметологии
Объявление (2) для слушателей Заочной школы научной косметологии

Написать в Заочную школу научной косметологии

Предыдущая страница К оглавлению Следующая страница





Рейтинг@Mail.ru
Главная  Новости  Каталог  Книги  КМЭ  Форум

ТУ  Гербарий  Golkom-Balance  Golkom-Post


Copyright © 2002-2017 "Библиотека природы"
По вопросам размещения рекламы на сайте: info@golkom.ru


Rambler's Top100